克山病心肌细胞的代谢特点——原发性代谢心肌坏死

克山病病因未明,在发病学上,克山病心脏极易受损,致使病死率仍然很高。为了探索克山病病死率高和心脏容易受损的原因,本文应用现代生化技术及定量病理学技术研究了克山病心肌细胞代谢障碍特点。十年来紧紧围绕克山病的靶组织心脏,通过85例克山病(包括正常对照及其他心肌病对照)人体心脏及大量病区粮饲养的实验动物模型心脏标本的生化研究,我们认为,克山病心肌损害的性质是一种典型的“原发性代谢性心肌坏死”,其主要证据是:     

皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca~(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。     

应用同种异体组织工程软骨修复关节软骨缺损观察

目的用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体支架在体外进行软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,利用此人工软骨修复关节软骨缺损。方法取2周龄兔关节软骨,经消化、分离的软骨细胞体外培养。培养第3周时,进行免疫组织化学分析;利用培养3周的人工软骨对异体成兔的关节软骨损伤进行修复。结果培养物内软骨细胞均得到较好存活,形成软骨陷窝,出现同源性细胞簇,分泌软骨基质;DNA和糖胺多糖(GAG)在培养第24天时达到高峰,分别为(5.18±0.19)、(214.3±2.8)μg/块;对异体关节软骨损伤的移植修复结果良好,在12周时,移植物与周边正常组织结合紧密、齐高,移植的软骨细胞趋于柱状排列,为透明软骨组织。结论用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可构建较大的组织工程软骨,能较好地修复同种异体关节软骨缺损。     

高效液相层析法分析糖胺多糖的二糖组成和性质

为了建立用高效液相层析分离糖多糖酶解产物二糖的方法。六种二糖浓度在４－７０ｍｇ／Ｌ范围均与高效液相色谱峰面积成线性关系，ｒ值分别为０．９９或０．９８；回收率在８７．６９％－９２．３１％；批纳变异系数均≤３．９５％；批间变异系数≤４．９２％。该方法简便、快速，灵敏，可广泛用于组织及体液糖胺多糖的结构和性质分析。     

组织工程与再生医学研究新进展

近年来，组织工程发展迅速。人们已经或正在构建具有生物活性的各种组织工程人工组织，如组织工程人工软骨、骨、皮肤、血管乃至人工肝等，并正在努力将这些“人工组织”植入人体，完成修复、替代病损组织的结构与功能。组织工程的发展和应用不仅可以减少伤残，挽救或延长生命，更重要的是，它标志着“再生医学”新时代的到来，是一场意义深远的医学革命。毫无疑问，随着生物工程的发展，将会赋予组织工程更为丰富的内涵。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的动物移植实验

背景：治疗由烧伤或疾病等引起的大面积全层皮肤缺失最为常见的和有效的方法就是皮肤移植修复，但目前面临的最大障碍是皮肤供体不足。以自体皮肤细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤是解决这一矛盾的最理想途径。目的：探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。设计：随机对照实验。单位：一所大学再生医学科学研究所及皮肤科。材料：实验于1998—09／2001—07在吉林大学细胞工程研究室完成。选用新生Wistar大鼠20只；8周龄雄性裸鼠24只。方法：应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(artificial skin，AS)组、壳多糖膜覆盖物(chitosan，CH)组及对照组(control gmup，CG)，术后进行大体观察，并在3，7，14和21d应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。主要观察指标：①实验动物大体观察情况。②修复区血供情况的红外热像观察。③组织学观察。结果：AS组在移植第3天，移植的组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长人移植物，皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化现象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成份增多；第14天，创面基本愈合；修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，瘢痕很小，无需进行二次植皮。至移植的第14天，CH组结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深。对照组的结痂脱落，创面大而深。颜色深红。结论：以壳多糖为基质网架构建的组织工程皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

过量氟化物对软骨基质糖胺多糖,蛋白多糖代谢的影响

在偏食和过量氟喂养条件下，实验大鼠软骨组织ＰＧ、ＧＡＧ代谢受到严重干扰，表现为肋软骨基质中ＰＧ聚合体含量明显降低，低聚合的ＰＧ含量明显增加，ＰＧ单体分子量明显降低。同时观察到软骨基南中ＧＡＧ含量的明显升高，这些结果一致地表明，过量氟化物引起动物慢性中毒辣时软骨组织ＰＧ合成代谢受到抑制而其分解代谢增强     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

急性心肌损害对心肌肌球蛋白磷酸化系统的影响

为探讨急性心肌损害对心肌肌球蛋白磷酸化系统的影响，选择对于心肌有特异性损害作用的异丙基肾上腺素（ＩＳＰ），造成大鼠实验性心肌损害的动物模型，动态观察心肌损害时肌球蛋白磷酸化系统的变化规律。研究结果表明，低剂量ＩＳＰ导致心肌匀浆中肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ）和肌动球蛋白ＡＴＰ酶的活性下降，但心肌组织病理切片基本正常；高剂量注射ＩＳＰ，ＭＬＣＫ和ＡＴＰ酶活性显著下降，与正常对照组和低剂量组相比，差异十分显著（Ｐ＜０．０１）。在病理形态学上大鼠心肌组织有多处较大的坏死灶。提示，在未发生明显的病理性变化前，心肌细胞内就已发生了一系列的代谢紊乱，如酶活性下降，心肌细胞的收缩功能发生改变；当心肌组织出现病理形态学改变时，细胞内酶活性显著下降，表明已由可逆性损害发展到不可逆的心肌坏死。     

软骨组织工程新技术的建立及其应用研究

1.软骨细胞分化调节机制的研究为在实验室条件下由软骨细胞重建软骨组织,先后研究了CDF,CATF,FCF,ConA,IGF-Ⅰ,PTH,TGF-β等八种软骨细胞分化调节因子的分离纯化和它们对软骨分化过程的调节作用。 2.由软骨细胞培养形成软骨组织的研究应用现代软骨细胞生物学和软骨细胞工程