改性羟基磷灰石骨修复纳米复合材料的制备及生物学评价

目的:制备羟基磷灰石/聚乳酸聚乙醇酸骨修复材料,并对其进行生物学评价。方法:实验于2006-06/2007-02在中科院长春应用化学研究所完成材料制备,在吉林大学基础医学院实验动物中心完成动物实验。将低聚乳酸的羧基与羟基磷灰石表面的钙原子用化学键连接,得到表面接枝聚左旋乳酸的羟基磷灰石,将其与聚乳酸聚乙醇酸共混,得到复合材料PLLA-g-HA/PLGA。溶于氯仿后铺膜(厚0.2mm),用DMEM培养液浸泡材料膜制备浸提液。首先,进行材料生物安全性实验:①细胞毒性实验:将浸提液与培养液混合,接种兔成骨细胞,培养24h,MTT法检测细胞增殖,计算细胞增殖率和细胞毒性级(细胞毒性级0或1级为合格)。②全身毒性实验:小鼠以50mL/kg的剂量静脉注射浸提液,观察72h内小鼠中毒症状。③皮肤刺激实验:兔脊柱两侧皮内注射材料浸提液,观察72h内皮肤有无异常反应。④热原实验:自兔耳缘静脉注入浸提液(10mL/kg)。注射后每0.5h测肛温1次,共6次,以6次中最高的1次减去正常体温,计为升高度数。其次,对复合材料进行细胞黏附性检测:将复合材料制成1%氯仿溶液,涂于硅化的盖玻片上,置于6孔板,每孔接种1×105个成骨细胞,培养3d,在2,24,72h行FITC荧光染色,数码摄像系统拍摄细胞荧光照片。结果:制备了新型PLLA-g-HA/PLGA复合材料。①生物安全性实验结果:MTT实验检测复合材料细胞增殖率为94.8%,细胞毒性级为1级;全身毒性实验中动物无死亡、惊厥、瘫痪、呼吸抑制、腹泻和体质量下降等不良反应;热原实验中兔体温最大的变化值是0.25℃(国家标准为<0.6℃);皮肤刺激实验中未见任何刺激反应,无红斑、焦痂、水肿表现。②细胞黏附性实验结果:细胞接种后2h可见少量细胞开始贴壁;24h时可见贴壁细胞明显增多,并呈聚集生长;培养3d后可见细胞逐渐融合,细胞状态良好。结论:新型PLLA-g-HA/PLGA复合材料符合生物材料细胞毒性要求,按毒性剂量分级属无毒级,无致热原性、对皮肤无刺激作用,具有良好的生物相容性和细胞黏附性。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

杂多化合物九钨三钛硅酸盐的毒性研究

目的：对杂多化合物九钨三钛硅酸盐（α-K8H2[SiW9Ti3O40].15H2O,α-Ti3）的毒性进行研究,为其临床应用提供科学依据。方法：采用小鼠经口急性毒性试验、蓄积毒性试验、Ames试验、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）染色体畸变试验和细胞毒性试验对α-Ti3毒性进行检测。结果：小鼠经口急性毒性试验的半数致死剂量（LD50）为2 055.36 mg/kg,属低毒物质;蓄积毒性试验提示α-Ti3在体内蓄积系数K〉5,为轻度蓄积;Ames试验在每皿31.3~500μg浓度范围内,无论加S9与否,每皿菌落回变数均未超过阴性对照组的两倍;中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变试验在40~320μg/ml范围内,无论加S9与否,CHO染色体畸变率与阴性对照组比较均无明显增加。对大鼠外周血细胞毒性和骨髓细胞毒性的半数抑制浓度（IC50）分别为0.135、0.223 mg/ml,高于S180腹水瘤细胞和小鼠肝癌细胞,说明该药对正常细胞的毒性作用较低。结论：在本实验条件下,杂多化合物九钨三钛硅酸盐属低毒物质,提示其具有良好的应用前景。     

脉冲电刺激对改性纳米羟基磷灰石/聚丙交酯-乙交酯复合材料表面

背景：目前,骨组织工程的研究主要集中在成骨细胞特性研究和骨修复材料研制两大领域,而对细胞与细胞外材料的相互作用,尤其是调节和促进两者间相互作用的相关研究尚未给予足够的重视。 目的：在低聚乳酸接枝纳米羟基磷灰石/聚丙交酯-乙交酯(Hydroxyapatite nanocrystals surface-grafted with L-lactic acid oligomer/ Poly(lactide-co-glycolide), op-HA/PLGA)复合材料上接种成骨细胞,观察脉冲电场刺激对成骨细胞增殖和成骨相关基因表达的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-05/2009-01在中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室完成。 材料：op-HA和PLGA由中科院长春应用化学研究所制备。 方法：实验分为PLGA无电刺激组、op-HA/PLGA无电刺激组、PLGA电刺激组和op-HA/PLGA电刺激组。将op-HA/PLGA和PLGA氯仿溶液分别于盖玻片表面铺成薄膜,并接种兔成骨细胞,体外培养7 d。电刺激组刺激电压为2 V,频率为1 Hz,占空比为20%,每天刺激1 h。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞周期,Real-time PCR检测骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白的表达。 结果：脉冲电刺激组op-HA/PLGA上生长的成骨细胞S期细胞百分比明显高于其他组(P < 0.05)。op-HA/PLGA与PLGA比较能上调骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白3种基因表达量,并且施加脉冲电刺激组骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白3种基因表达量高于未加电刺激组。 结论：op-HA/PLGA复合材料是一种很好的骨修复材料,脉冲电刺激能促进成骨细胞在材料上的增殖能力,提高成骨活性相关基因的表达水平。     

左旋聚乳酸颈椎可吸收固定板的力学性能测试

背景：课题组已成功利用左旋聚乳酸的有限固定强度和可吸收的特性制成了新型颈椎可吸收固定板。 目的：进行动物体内降解和力学实验,以测定新型可吸收颈椎左旋聚乳酸固定板的生物力学性能。 方法：将长30 mm, 宽5.5 mm, 厚度为2.0 mm的试样经环氧乙烷消毒后,植入至15只兔的背部肌肉内,分别于术后1,3,5,7个月取出,观察材料的降解变化和机械性能的变化。 结果与结论：植入1~5个月,外观观察材料植入体内后未发生明显改变。植入1~7个月材料体积和质量均未发生明显改变。植入1个月冲击强度未发生明显变化,植入3个月略有下降,后又逐渐上升,至7个月时达到甚至超过术前水平。植入后随着时间延长左旋聚乳酸板的弯曲强度呈逐渐下降趋势,但7个月内下降幅度并不显著。术后3~7个月扭转强度略有下降,但并不明显。结果表明,左旋聚乳酸的生物力学强度足够维持骨性融合的全过程,用其制成的颈椎前路固定板可以用于颈椎前路手术的植骨融合固定。 关键词：左旋聚乳酸;可吸收;固定板;颈椎融合术;生物相容性材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.12.025     

二甲基砜/聚乙烯醇水凝胶的制备及其生物学特性评价

目的：制备二甲基砜/聚乙烯醇（MSM/PVA）水凝胶,评价其生物学特性,探讨不同MSM含量的MSM/PVA水凝胶作为人工敷料的可行性。 方法：采用反复冷冻法制备MSM/PVA水凝胶,采用场发射环境电子显微镜观察其微观结构,并检测其脱水率、二次溶胀率、水蒸气透过率、MSM损失量及释放量,采用MTT法检测MSM/PVA水凝胶敷料浸提液于490 nm波长处的吸光度（A）值,并计算细胞增殖抑制率。采用HE染色法检测MSM/PVA水凝胶敷料对豚鼠烫伤创面愈合的影响。 结果：以12%的PVA水凝胶为载体制备MSM/PVA水凝胶,扫描电镜下MSM/PVA水凝胶具有致密的多空孔结构。不同MSM含量（0.01%、0.10%、1.00%和10.00%）的MSM/PVA组与PVA组比较,脱水率、二次溶胀率和水蒸气透过率差异均无统计学意义（均P>0.05）;电感耦合等离子体发射光谱(ICP)检测,MSM在水凝胶中含量在80%以上;MSM/PVA水凝胶中MSM缓慢释放;〖JP3〗MSM/PVA各组MSM释放率比较,差异无统计学意义（均P>0.05）;MSM/PVA各组A值与对照组比较,差异无统计学意义（均P>0.05）;0.10%MSM/PVA组A值与PVA组比较,差异有统计学意义（P< 0.05）;光镜下0.10%、1.00%和10.00%MSM/PVA组30　d后豚鼠烫伤创面的愈合情况较好。 结论：MSM/PVA水凝胶具有较好的生物学活性,MSM 含量为0.10%和1.00% 的MSM/PVA水凝胶更有利于小鼠成纤维细胞L929的增殖和烫伤豚鼠创面的愈合〖JP3〗;MSM含量为0.10%和1.00%时, MSM/PVA水凝胶可作为人工敷料,对皮肤烫伤修复有促进作用。
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皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca~(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。     

杂多化合物九钨三钛硅酸盐致畸毒性研究

目的 :观察九钨三钛硅酸盐 ( α- K8H2 〔Si W9Ti3 O4 0 〕· 1 5H2 O,简称 α- Ti3 )孕期给药对大鼠胎仔的毒性影响。方法 :大鼠孕期以 57.0 9,1 71 .2 8和 51 3.83mg/ kg剂量经口给予α- Ti3 ,并以Vit A为阳性对照及蒸馏水为阴性对照 ,产前剖腹检测胎鼠生长发育指标、外观内脏骨骼形态等。结果 :三个剂量组均未见胎鼠外观、内脏及骨骼畸形。低剂量组与高剂量组的活胎率升高 ,吸收胎数下降 ,与阴性对照组比较有显著性差异 (均为 P<0 .0 5)。低、中、高剂量组的胎鼠体重和身长高于阴性对照组 (分别为 P<0 .0 5,P<0 .0 1 ,P<0 .0 1 ) ,且增长程度与剂量呈正相关 ( r=0 .840 8,0 .72 2 8,P<0 .0 0 5,0 .0 5)。低、中、高三个剂量组的上枕骨骨化程度及胸骨块数高于阴性对照组和阳性对照组 ( P<0 .0 5,0 .0 1 ,0 .0 1 ,0 .0 5和 P<0 .0 5,0 .0 1 ,0 .0 1 )。各剂量组的母鼠肝脏重量及肝体比值不同程度下降。其中 ,中、高剂量组及阳性对照组的肝重及肝体比值与阴性对照组比较差异显著 (肝重比较分别为 P<0 .0 5,P<0 .0 5和 P<0 .0 1 ,肝体比值比较均为 P<0 .0 5)。结论 :α- Ti3 致畸试验未见胎鼠畸形 ,但可提高胎鼠生长发育指标和骨骼骨化程度。     

组织工程与再生医学研究新进展

近年来，组织工程发展迅速。人们已经或正在构建具有生物活性的各种组织工程人工组织，如组织工程人工软骨、骨、皮肤、血管乃至人工肝等，并正在努力将这些“人工组织”植入人体，完成修复、替代病损组织的结构与功能。组织工程的发展和应用不仅可以减少伤残，挽救或延长生命，更重要的是，它标志着“再生医学”新时代的到来，是一场意义深远的医学革命。毫无疑问，随着生物工程的发展，将会赋予组织工程更为丰富的内涵。     

不同电刺激信号对大鼠雪旺细胞增殖的影响

目的研究不同的电刺激信号对大鼠雪旺细胞(RSC96)增殖的影响。方法实验使用RSC96细胞系(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),经过2次传代培养,以1.25×10~4/孔的密度种植于24孔细胞培养板中,次日电刺激信号分别采用不同的电压(10、100、500、1 000、5 000、10 000 m V/cm)、不同的频率(0.1、1.0、100.0、1 000.0、10 000.0、1 000 000.0 Hz)、不同的脉冲占空比(5%、10%、30%、50%、70%、90%)及不同的波形(正脉冲波、矩形波、三角波、正弦波、杂波、直流波)对细胞进行电刺激,每组设置3个平行样,细胞每天刺激30 min,持续刺激4 d。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率。结果当电刺激频率为100.0 Hz、脉冲占空比为50%、波形为矩形波时,电压500 m V/cm时对细胞的增殖具有抑制作用。当电刺激频率为100.0 Hz、脉冲占空比为50%、电压为500 m V/cm时,正脉冲波、正弦波、矩形波和三角波都能够促进细胞的增殖。当电刺激波形为矩形波、脉冲占空比为50%、电压为500 m V/cm时,频率100.0~1 000.0 Hz组细胞增殖率最高。当电刺激波形为矩形波、频率为100.0 Hz、电压为500 m V/cm时,不同的脉冲占空比对细胞增殖的影响不明显。结论不同的电刺激信号条件对细胞增殖的影响较大。电压≤500 m V/cm、有规律的脉冲波形、频率为100.0~1 000.0 Hz电刺激信号能够获得较好的RSC96增殖的效果。实验所获得的优化电刺激参数在外周神经修复中具有非常大的应用前景。