胶原诱导性关节炎大鼠滑膜双向凝胶电泳图谱建立及差异分析

目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一个多基因多因素参与的病理过程。实验中通过建立与RA发病机制相似的胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠动物模型,运用蛋白质组技术对正常大鼠和CIA大鼠模型不同时间点滑膜组织的蛋白质点进行比较分析,为鉴定CIA大鼠滑膜病变相关蛋白质及研究RA发病机制奠定基础。方法用牛Ⅱ型胶原和完全福氏佐剂建立CIA大鼠模型,采用一步抽提法抽提滑膜蛋白质,运用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各组大鼠滑膜组织的总蛋白质,用PDquest软件分析图谱,比较差异蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应肽质指纹图谱,用Mascot查询软件搜索数据库,鉴定部分差异蛋白质。结果成功建立了CIA大鼠模型,获得分辨率较高、重复性较好的大鼠滑膜组织双向电泳凝胶图谱。正常组与25、35和45天模型组大鼠滑膜组织凝胶图谱的平均蛋白质点数分别为1070±41、1049±22、1079±44和1088±39。在4个组均有表达差异的蛋白质点中随机取20个点进行肽质指纹图分析,鉴定了部分与细胞代谢、信号转导及结构相关的差异表达蛋白质。结论建立了分辨率较高且重复性较好的正常大鼠与CIA大鼠不同时间点滑膜组织的双向凝胶电泳图谱,鉴定了一些与CIA大鼠滑膜病变相关的差异表达蛋白质,为识别RA病变相关蛋白质及推断RA病变过程奠定基础。     

脑梗死肝阳化风证患者外周血淋巴细胞凝胶图谱分析

目的建立脑梗死肝阳化风证高分辨率的二维凝胶电泳图谱,从蛋白质组学角度探讨脑梗死中医肝阳化风证的本质内涵。方法设脑梗死肝阳化风证组、健康人对照组、脑梗死阴虚生风证对照组3组,取外周静脉血分离淋巴细胞提取蛋白质,经双向凝胶电泳,考马斯亮蓝染色获取凝胶图谱,PDQuestV7.3.1软件比较分析3组图谱并识别差异表达蛋白质点。结果建立了脑梗死肝阳化风证、健康人组、脑梗死阴虚生风证患者外周静脉血淋巴细胞2-DE图谱,分别获得蛋白质点459个,552个,644个;通过分析比较,发现了脑梗死肝阳化风证与阴虚生风证的相同蛋白质点8个,差异蛋白质点23个。结论提示相类证有共同的物质基础,同病异证有不同的本质内涵,为进一步研究中医肝阳化风证本质内涵奠定了科学基础。     

胶原诱导性关节炎大鼠滑膜病变的蛋白质组学研究

目的探讨胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠滑膜病变的蛋白质组学研究,为类风湿关节炎(RA)的发病及治疗提供新的线索。方法30只采用皮下注射牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂诱导的SD大鼠CIA诱导性关节炎(CIA)模型,应用双向凝胶电泳(2DE)技术分离正常组、CIA模型组大鼠关节滑膜的总蛋白后,经胶体考染显色、图像分析、识别差异表达的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质量指纹图谱(PMF),然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点,运用western blotting方法验证差异表达蛋白质。结果建立了正常组、CIA模型组大鼠滑膜的双向凝胶电泳图谱,平均点数为(1020±40)个蛋白质点,平均匹配率为(93．2±2．1)%；发现并鉴定了两组滑膜差异表达大于2倍的蛋白质点35个,这些与滑膜病变相关的差异表达蛋白质的功能涉及物质代谢、能量产生、物质转运、抗氧化、信号转导及细胞骨架蛋白,随即用western blotting方法验证差异蛋白质annexinⅠ、aldolase A在正常组和CIA模型组中的表达,其结果也显示了类似的表达差异。结论建立了正常组、CIA模型组大鼠关节滑膜的双向凝胶电泳图谱,鉴定了35个与CIA滑膜病变相关的差异表达的蛋白质,这些差异蛋白质可能以不同的方式参与了病变过程,为揭示CIA滑膜病变的机制及RA的发病机制提供了新的线索,而且annexinⅠ、aldolase A的验证结果与蛋白质组结果的一致性表明,AnnexinⅠ、aldolase A可能与CIA的关节滑膜病变有关。     

染色体3p14.2-14.3区域一个与鼻咽癌相关新基因的克隆

目的：在染色体３ｐ１４．２－１４．３区域寻找与鼻咽癌发生发展密切相关的新基因。方法：运用ＲＡＣＥ方法获取基因全长ｃＤＮＡ序列,ｐＥＧＦＰ质粒和脂质体共转染ＣＯＳ７细胞进行新基因的蛋白质定位。结果：在３ｐ１４．２－１４．３区域克隆了一个在鼻咽癌中表达不调新基因的全长ｃＤＮＡ序列,被命名为ＣＰＣＤＲ１,编码１０９个氨基酸,其蛋白质聚集在细胞核内,其基因组由２个外显子和１个内含子组成。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印     

喉癌相关基因 LCRG1蛋白的细胞亚定位及生物学特性研究

目的：研究我们实验室最近克隆的喉癌相关基因LCRG1编码蛋白的细胞定位以及其是否具有抑瘤功能。方法：采用绿色荧光蛋白（GFP）荧光定位的方法,研究该基因编码蛋白的细胞亚定位;通过绘制细胞生长曲线,以及运用转染细胞软琼脂集落形成试验和裸鼠致瘤试验,研究喉癌相关基因LCRG1在喉癌细胞系Hep-2中的生物学特性。结果：喉癌相关基因LCRG1编码的蛋白定位在细胞核内;将CLRG1cDNA导入到不表达该基因的喉癌细胞系Hep-2中,观察到明显的生长抑制作用,表现为抑制Hep－2细胞的停泊非依赖性生长和抑制裸鼠致瘤性。结论 ：喉癌相关基因LCRG1具有一定的抑瘤功能。     

三种EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因载体的构建

为制备ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）基因转基因小鼠,探讨ＬＭＰ的体内致瘤作用,本文构建了三种不同的ＬＭＰ基因转基因载体,即ｐＢＲ３２２ＭＴＬＭＰ,ｐＭｃｉ３ＬＭＰ和ｐＭＶＬＭＰｃｍｙｃ;并分别讨论了上述三种载体的特征及其应用前景     

蛋白质组学方法研究TPx在肝风内动证中的表达及关系

目的：从蛋白质组学角度研究中医肝风内动证的可能的标志性蛋白——硫氧环蛋白过氧化物酶（Peroxiredoxin／Thioredoxin peroxidase，TPx）在中医肝风内动三亚型中的表达，探讨其与中医肝风内动证的关系。方法：设肝阳化风证、血虚生风证、阴虚生风证、健康人组4组，抽取外周静脉血淋巴细胞并提取总蛋白行二维凝胶电泳，PDquestV7．3．1软件分析，质谱分析鉴定，找出各组共有的差异蛋白。结果：鉴定硫氧环蛋白过氧化物酶（Peroxiredoxin／Thioredoxin peroxidase，TPx）为中医肝风内动证与健康人组比较共同的差异蛋白。结论：硫氧环蛋白过氧化物酶（TPx）可能是中医肝风内动证的特异的标志蛋白。     

镇肝熄风汤对脑出血肝阳化风证患者外周血单个核细胞蛋白质组学的影响

目的:观察镇肝熄风汤治疗脑出血肝阳化风证(方证相应)前后外周血单个核细胞蛋白质双向凝胶电泳图谱的动态变化,探讨脑出血肝阳化风证的蛋白质表达规律,寻找镇肝熄风汤所作用的蛋白及疗效机制.方法:利用固相梯度双向凝胶电泳技术建立脑出血(10例)肝阳化风证镇肝熄风汤治疗10日前后及健康对照组(10例)外周血单个核细胞蛋白双向凝胶电泳图谱,经PDQuest8.0软件分析,选取差异表达的蛋白质点,应用MALDI-TOF-MS质谱仪获得肽质量指纹图谱.用Mascot软件搜索数据库鉴定部分差异蛋白质.结果:筛选出22个差异表达蛋白质点,其中脑出血肝阳化风证与健康对照组比较有20个差异表达蛋白质点,8个表达下调,7个表达上调,5个缺失;脑出血肝阳化风证经镇肝熄风汤治疗后与健康对照组比较4个表达下调,5个表达上调,2个缺失,9个表达与健康人无明显差异;在挖取的20个蛋白质点中有8个得到鉴定,其中脑出血肝阳化风证与健康对照组比较6个表达下调,1个表达上调,1个缺失;脑出血肝阳化风证经镇肝熄风汤治疗后与健康对照组比较2个表达下调,1个蛋白缺失,5个表达与健康人无明显差异.结论:初步建立了脑出血肝阳化风证外周血单个核细胞蛋白双向凝胶电泳图谱,初步鉴定了部分与脑出血肝阳化风证相关的蛋白及镇肝熄风汤可能的多靶点蛋白调节机制,这些蛋白功能涉及细胞代谢、信号转导、电子传递、细胞骨架等.     

一个新的NPCEDRG基因mRNA剪接变异体的克隆及鉴定

目的:克隆并鉴定NPCEDRG基因mRNA剪接变异体.方法:利用5’-RACE、3’-RACE在CNE2细胞中对NPCEDRG基因mRNA剪接变异体进行扩增,T/A克隆入pMD20载体,所获得的阳性重组子经测序证实.结果:成功克隆得到一种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CD...     

痹肿消汤对胶原性关节炎大鼠滑膜双向电泳蛋白质表达的影响

目的:分析痹肿消汤(bizhongxiao decoction,BZXD)对胶原性关节炎大鼠滑膜双向电泳蛋白质表达谱的影响,为阐明痹肿消汤治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)作用机制提供新线索。方法:70只SD大鼠随机分为正常对照组(正常组)、模型对照组(模型组)、痹肿消汤治疗组(BZXD组),采用皮下注射牛Ⅱ型胶原与完全福氏佐剂制成实验性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型。应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分别分离正常组、模型组、BZXD组大鼠关节滑膜的总蛋白后,胶体考马斯亮蓝染色,扫描2-DE胶获取电子图像,Pdquest图像分析软件比较分析此3组双向凝胶电泳图谱并识别差异表达的蛋白质。结果:成功复制了CIA大鼠模型;建立了正常组、模型组和BZXD组大鼠滑膜的2-DE图谱,其平均蛋白质点数分别为947±39,994±41,1031±52,其匹配率为92%,91%,94.2%;模型组的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)方向的偏差是(0.896±0.217)mm,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方向的偏差为(1.102±0.104)mm。比较分析模型组和BZXD组大鼠滑膜的2-DE图谱,发现此2组间有328个差异点,BZXD组有174蛋白质点表达上调,147个蛋白质点表达下调,7个蛋白质点只在模型组表达。模型组与正常组之间有193个差异点,123个在模型组表达上调,70个表达下调。结论:建立了CIA大鼠关节滑膜的双向凝胶电泳图谱,识别了328个差异表达的蛋白质,对这些差异蛋白质的鉴定将为痹肿消汤治疗RA的作用机制提供新的实验依据。