一种基于N基因的麻疹病毒实时荧光RT-PCR检测技术

目的引进一种以检测麻疹病毒N基因为目标的荧光RT-PCR技术并运用到新余市麻疹常规监测工作。方法新荧光RT-PCR与国产的荧光RT-PCR试剂盒、IgM抗体ELISA检测试剂盒分别对新余市2014年所采集麻疹疑似病例咽拭子、血清样本进行检测和结果分析。结果新荧光RT-PCR、国产的荧光RT-PCR试剂盒、ELISA试剂盒的检测阳性率分别为25.53%、23.4%、17.02%。与ELISA相比,RT-PCR具有更好的检测灵敏度,且两种荧光RT-PCR之间的总符合率达到97.87%。结论新引进的方法很敏感,适用于麻疹实验室监测以及疑似病例的快速诊断。     

快速检测汉滩病毒新型实时荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

目的建立一种汉滩型汉坦病毒(Hantaan virus,HTNV)荧光定量(RT-PCR)的检测方法,以便快速准确地检测HTNV。方法利用Beacon Designer7.0设计引物和探针,以HTNV的S基因片段为模板,进行实时荧光定量RT-PCR,评价此方法的特异性及灵敏度。结果建立的RT-PCR方法对HTNV的最低检出限为4.08copies/μL,模板Ct值与稀释浓度的对数之间具有良好的线性关系,标准曲线方程为Y=-3.4118X+41.997,扩增效率为96.4%,R2=0.994。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可应用于HTNV的快速检测。     

抑癌基因FHIT和WWOX在膀胱癌中的表达

目的:探讨FHIT和WWOX基因及其蛋白在膀胱癌及癌旁正常组织的表。方法:采用免疫组化(SP)法检测FHIT和WWOX蛋白在膀胱癌组织中表达;运用RT-PCR法检测FHIT和WWOXmRNA在膀胱癌及癌旁正常组织表达。结果:FHIT和WWOX蛋白表达在中与低分化组及高与低分化组间差异显著,有统计学意义(P0.05)。在分期中表达的缺失都具有显著性差异(P0.05)。FHITmRNA和WWOXmRNA在膀胱癌中表达低于癌旁正常组织(P0.05),且两者表达呈正相关性。结论:FHIT和WWOX在膀胱癌的发生发展过程中起着一定协同抑癌作用。     

循环miRNAs分析检测方法研究进展

循环miRNAs是重要的毒性标志分子,其含量极低、序列多样和长度较短的特性给分析检测带来挑战,成为决定其应用于新化学物质和材料的毒理学研究和临床应用的关键。该文综述了目前可用于循环miRNA分析检测的方法,包括传统微阵列法、测序法、RT-PCR法和生物传感方法,并对这些方法的技术特点和检测中存在的主要问题进行论述。     

胡桃醌对小鼠SH-SY5Y神经母细胞瘤干预后相关差异基因表达变化及通路分析

目的探索胡桃醌导致小鼠SH-SY5Y神经母细胞瘤凋亡的机理。方法采用转录组技术,对胡桃醌干预小鼠SH-SY5Y神经母细胞瘤后的差异基因进行分析,并选择其中显著性基因,围绕其信号通路分析促凋亡机理,并采用Westem-blot 及RT-PCR等实验方法进行验证。结果采用 Rwith edgeR package进行差异基因分析,共找到821个差异基因。通过KEGG注释,确定了p53信号通路,实验验证表明,不同浓度胡桃醌诱导SH-SY5Y细胞凋亡后p53基因及mRNA表达水平明显增强,其表达量随着胡桃醌浓度的升高而升高。结论胡桃醌导致SH-SY5Y神经母细胞凋亡的机制可能是胡桃醌能明显上调p53 mRNA及p53的表达,从而诱导小鼠SH-SY5Y神经母细胞凋亡。     

基于18SrRNA序列的云南大叶千斤拔与细叶千斤拔根内丛枝菌根真菌鉴定

目的:调查云南省大叶千斤拔(Flemingia macrophylla)与细叶千斤拔(Flemingia lineata)根内丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)群落结构多样性。方法:使用巢式-PCR、克隆、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析及测序技术。结果:共获得558个含有丛枝菌根真菌18S rRNA片段的克隆子,经RFLP分析后得到83个RFLP类型,DNA序列分析可将其划分为23个可操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs),分属于5个科,Glomeraceae为优势类群。在MaarjAM数据库中进行比对后,23个OTUs可鉴定为18个虚拟分类分子种,分布于13种不同的生境。经统计分析大叶千斤拔与细叶千斤拔根内丛枝菌根真菌群落组成比较,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:比较大叶千斤拔与细叶千斤拔根内丛枝菌根真菌群落差异,结合丛枝菌根真菌在生态系统中的分布特点,为种植千斤拔属植物的选址提供有力地环境指标数据,并为筛选促生菌株提供依据。     

大花胡麻草环烯醚萜合酶基因的克隆与表达分析

目的克隆大花胡麻草环烯醚萜合酶基因(CgIS),并进行表达分析。方法以大花胡麻草根、茎、叶转录组中唯一的CgIS基因序列为基础,采用RT-PCR技术从大花胡麻草幼叶克隆CgIS基因,并进行组织特异性表达分析。结果大花胡麻草CgIS基因(GenBank登录号MH794270)全长1 185 bp,编码394个氨基酸;CgIS蛋白相对相对分子质量44 670,理论pI为6.17;该蛋白属于孕酮5β-还原酶(P5β-R)家族成员,可能定位于细胞质;该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋(40.61%)和无规则卷曲(46.70%)构成;该蛋白具有SDR(短链脱氢酶/还原酶)和P5βR蛋白保守结构域;CgIS蛋白与芝麻SiIS蛋白亲缘关系最近;CgIS基因主要在叶中表达。结论克隆了CgIS基因,并对其进行表达分析,为进一步研究该基因的功能和环烯醚萜类的生物合成途径奠定基础。     

实时荧光RT-PCR检测20份流感考核盲样

目的将实时荧光RT-PCR法应用于流感病毒盲样考核中,以便及时找出问题。方法设计高度特异性的引物,采用实时荧光RT-PCR法对2011年和2012年国家下发的共20份流感考核盲样进行检测。结果经实时荧光RT-PCR法检测,2011年10份盲样中B型2份,新甲型H1N1 2份,季节性H1亚型1份,季节性H3亚型2份,禽流感H5亚型1份,阴性2份。2012年10份考核盲样10份盲样中B型流感1份,新甲型H1N1 1份,季节性H1亚型1份,季节性H3亚型2份,禽流感H5亚型2份,阴性3份。根据国家流感中心的反馈,各年度正确率100%。结论将实时荧光RT-PCR法应用于流感盲样考核中,保证了检测结果的准确性。     

G6PD缺乏症单细胞SNaPshot基因诊断方法的建立

目的建立有效可行的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症单细胞基因诊断技术。方法获取正常人及G6PD基因突变杂合子的单个淋巴细胞,采用多重巢式PCR结合多重SNaPshot技术对G6PD基因突变高发的四个外显子上的12个突变位点进行基因诊断。结果共检测了58个正常和108个杂合子单淋巴细胞,扩增效率为90.97%,等位基因脱扣率为8.08%。结论所建立的多重巢式PCR结合SNaPshot技术可在单细胞水平上快速、准确地检测12个G6PD基因突变位点,可望在临床上实现G6PD缺乏症的植入前遗传学诊断。     

2007—2013年上海南翔地区呼吸道感染儿童鼻咽部病毒病原学哨点监测及分析

目的常年监测分析上海市南翔地区呼吸道感染儿童病毒病原学情况。方法采集2007年1月至2013年9月门诊急性呼吸道感染患儿4 389例鼻咽分泌物,多重逆转录PCR法(Multiplex RT-PCR)检测9种呼吸道病毒,包括流感病毒(FLU)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、人博卡病毒(HBOV)、人冠状病毒(Cov)、肠病毒(EV)、人偏肺炎病毒(HMPV)、鼻病毒(HRV)。同期采集无呼吸道感染症状儿童鼻咽分泌物标本123例,同时多重逆转录PCR法检测9种呼吸道病毒。结果 4 389例呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本中呼吸道病毒阳性检出率为34.8%(1526/4389),前3位病毒依次为FLU 10.3%(453/4389)、RSV 7.3%(320/4389)和PIV 6.2%(274/4389);2种及2种以上呼吸道病毒混合感染273例(6.2%)。不同年龄组病毒总检出率差异有统计学意义(χ2=41.91,P0.001),学龄组儿童检出率最低为23.4%,其余3组检出率均≥35.0%;RSV、HRV在婴儿组检出率均较高;FLU在学龄组儿童中检出率较高为13.6%。儿童喘息性疾病中存在较高的病毒检出率,其中RSV检出率14.8%(30/204),其次为HBOV 13.8%(28/204)。同期采集无呼吸道感染症状儿童鼻咽分泌物标本123例,病毒检出率6.5%(8/123),与呼吸道感染组病毒检出率比较,差异有统计学意义(χ2=42.60,P0.001)。结论在连续7年的常年检测中,FLU、RSV在该地区儿童呼吸道感染性疾病中占重要地位。不同年龄组病毒检出率存在差异,婴幼儿呼吸道感染有较高的病毒检出率,RSV检出率较高;随年龄增长,总体病毒检出率下降,但流感病毒在大年龄组的检出率增高。