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1.
一个新的高血压病相关基因的克隆和表达   总被引:33,自引:1,他引:32  
目的寻找和克隆新的高血压病相关基因,探讨高血压病的发病机制。方法应用差异显示筛选的方法,对正常(WKY)大鼠和自发性高血压病大鼠(SHR)血管平滑肌细胞进行RNAmapping分析,选择下调的cDNA进行克隆。结果获得一个新的cDNA,其长度为4160bp,可编码551个氨基酸,蛋白质分子量为62644。Northernblot分析证明,这一基因不仅存在于血管平滑肌细胞中,而且也广泛分布在大鼠心、肾、脑、肺和肝组织中。这一基因在SHR大鼠的心、肾、脑、肝中低表达,在WKY大鼠高表达;血管紧张素II、内皮素-1、IL-1等致血管平滑肌细胞增殖和高血压的因素可以抑制这一基因的表达,其作用可为相应的拮抗剂所阻断;心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素等抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和降低高血压的因素可以上调这一基因的表达。结论获得了一种新的与血管平滑肌细胞增殖或高血压相关的基因,它可能拮抗VSMC增殖,在高血压的发生中起重要作用。  相似文献
2.
神经干细胞的分离培养及其鉴定   总被引:25,自引:5,他引:20  
目的:从成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离并鉴定神经干细胞。方法:利用无血甭培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离具有单细胞克隆能力的细胞群,选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆,采用免疫荧光细胞化学技术检测克隆细胞Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果:从纹状体区和皮层分离的细胞群具有连续克隆能力,胚胎早期细胞抗原-Nestin抗原阳性,分化后的细胞表达神经元  相似文献
3.
利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒   总被引:23,自引:9,他引:14  
4.
新疆紫草素对肿瘤细胞生长抑制作用的研究   总被引:20,自引:0,他引:20  
目的:探讨新疆紫草案对小鼠胶质瘤细胞C6、人舌鳞癌细胞Tca—8113和人宫颈癌细胞HeLa细胞的体外生长抑制作用。方法:显微镜观察经新疆紫草案作用后细胞形态的变化;应用MTT法和平板克隆形成法检测新疆紫草案对小鼠胶质瘤细胞C6、人舌鳞癌细胞Tca—8113和人宫颈癌细胞HeLa的生长抑制作用。结果:新疆紫草案对C6、Tca—8113和HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用。但作用方式不同,对C6和Tca—8113主要以作用于细胞质为主,细胞以坏死为主,而对于HeLa细胞则主要作用于细胞核,引起细胞的凋亡。结论:本研究表明,在体外实验中,新疆紫草案对小鼠胶质瘤细胞C6、人舌鳞癌细胞Tca—8113和人官颈癌细胞HeLa细胞3种不同类型的肿瘤细胞均具有明显的杀伤和抑制作用,表现出剂量一效应关系。待进一步研究后,作为抗肿瘤药物可以应用于临床。  相似文献
5.
pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化   总被引:18,自引:8,他引:10  
目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2 -树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。  相似文献
6.
子宫平滑肌瘤的克隆性分析   总被引:17,自引:4,他引:13  
目的 根据女性细胞中两条X染色体上甘油磷酸激酶(PGK)基因多态性,建立克隆性分析技术,并探讨子宫平滑肌瘤的克隆性。方法 从新癣子宫平滑肌瘤组织中提取DNA,用限制性内切酶HpaⅡ消化样品后,PCR扩增,产物再经BstXI内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳显示结果。结果 在扩增成功的32例标本中,10例(31%)具有BstXI酶切位点的多态性。其中1例X染色体失活发生了严重的偏移,不适合作克隆性分析。对其中7例标本、15个肿瘤结节进行了克隆性分析。结果显示,7例中15个肿瘤结节全部为单克隆性起源,其中2例(分别有2个肌瘤)的肿瘤结节起源于不同的克隆,1例中相邻的6个肌瘤结节具有相同的酶切带型,提示不同肿瘤结节起源于同一克隆。结论(1)运用PGK克隆性分析技术有助于局灶性或结节性病变性质的确定;(2)子宫平滑肌瘤是单克隆细胞群体;多发性平滑肌瘤中,多数病例不同肿瘤结节相互独立,有的病例不同的瘤结节具有相同的细胞起源。  相似文献
7.
大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定   总被引:14,自引:3,他引:11  
目的:克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)基因,构建其表达载体。方法:采用高保真PCR分别从E.coli44815株与V.cholerae东74株基因组DNA中扩增LTB与CTB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。分别构建pET32a的LTB及CTB表达载体,在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE及GM1-ELISA鉴定表达产物。结果:所克隆的LTB和CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为99.12%-99.71%和98.54%-99.42%,氨基酸序列同源性分别高达97.58%-99.19%和96.77%-99.19%。pET32a-LTB-BL21DE3和pET32a-CTB-BL21DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的30%和10%左右。GM1-ELISA结果证实LTB及CTB融合蛋白均能与牛GM1结合。结论:本研究成功地构建了LTB与CTB表达系统,所表达的LTB与CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。  相似文献
8.
新基因ANGPTL4的克隆及其在血管新生中的功能研究   总被引:14,自引:0,他引:14  
Zhu H  Li J  Qin W  Yang Y  He X  Wan D  Gu J 《Zhonghua yi xue za zhi》2002,82(2):94-99
目的 克隆新基因ANGPTL4 ,并探讨其功能。方法 采用以细胞生长为基础的功能筛选方法筛选人胎盘cDNA文库 ,结合RACE PCR方法克隆到一个人全长新基因ANGPTL4 ,用RH PCR方法对其进行染色体定位 ;用原核表达系统对重组ANGPTL4进行蛋白表达 ;用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)试验、原代猪主动脉内皮细胞 (PAEC)体外迁移试验、PAEC体外浸润试验、PAEC体外管状试验及小鼠体内栓子形成试验探讨了新基因ANGPTL4对体内外血管新生过程的影响。结果 获取的人全长基因ANGPTL4定位于染色体 19p13 3,其原核表达产物对PAEC的体外增殖没有明显作用 (P =0 0 5 04 ) ,但ANGPTL4的 2 μg/ml剂量组对PAEC的体外迁移和浸润均有明显的促进作用 (P <0 0 5 ) ,对其管状结构形成也有程度不同的促进作用 ;对小鼠体内血管新生有较明显的促进作用。结论 新基因ANGPTL4对血管新生有促进作用  相似文献
9.
大肠杆菌S—腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达   总被引:14,自引:0,他引:14  
应用PCR技术从E.coli JM109中扩增出长约1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其插入高表达载体pET11c的NdeI和BamHI位点中,转化E.coli BL21(DE3)。SDS-PAGE和薄层扫描结果表明,重组菌S-腺苷甲硫 酸合成酶的表达量点菌体总可溶性蛋白含量的58.3%,酶活测定结果表明,重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力比宿主菌高7倍。  相似文献
10.
获得鼠抗人精浆蛋白单抗可变区基因,为单链抗体的构建及表达奠定基础。方法;从分泌抗人精浆蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经反转录,PCXR分离获得了γ-Sm-McAb轻链可变区基因和重链可变区基因,分别克隆入pUC19质粒中,用全自动荧光DNA序列分析仪对VH,VL基因序列进行了分析。  相似文献
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