糖尿病的基因治疗技术:大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

目的:构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒pCMV/proinsulin并进行序列测定。方法:实验选用雄性SD大鼠1只,从大鼠胰腺组织中提取总RNA,通过RT-PCR法获得胰岛素原基因cDNA全长序列,并采用现代分子生物学技术,借助真核细胞表达质粒pCMV-Scriptvector具有多克隆酶切位点的特点,选择适当的限制性酶切位点(EcoRⅠ和HindⅢ),并使大鼠胰岛素原基因cDNA两端带有相同的酶切位点,利用其黏性末端进行定向克隆,从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒pCMV上。结果:经RT-PCR法扩增并通过DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因。经PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子,并进一步进行DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法),确定其序列与目的基因序列完全一致。结论:成功构建重组质粒pCMV/proinsulin,为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞,使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础。     

一个含重复序列的区域与杜氏利什曼原虫婴儿亚种核糖体RNA基因的转录终止相关

多数真核生物的核糖体RNA(rRNA)基因的构成相似,即多个头-尾重复序列由非转录间隔区(NTS)将前体编码区域隔开而组成。已发现,基因的间隔区或NTS中的重复序列与前体核糖体RNA(pre-rRNA)转录的调节有关。 作者以利什曼原虫总DNA为探针,对     

日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选与免疫学鉴定

目的　从噬菌体表面显示肽库筛选并鉴定日本血吸虫特异性IgE抗体相关表位。 方法用ABC 酶联免疫吸附 (ELISA)法检测日本血吸虫病流行区居民血清 15 0份 ,选择其中 15份具高滴度血吸虫特异性IgE抗体的血清 ,混合后经蛋白G柱亲和层析祛除IgG抗体 ,用于对 12肽的噬菌体表面显示肽库进行 5轮免疫亲和淘筛。从所获噬菌体克隆中挑取 35个克隆 ,经DNA序列测定 ,对各独立肽表位进行免疫学鉴定。结果　经 5轮筛选 ,DNA序列测定显示共有 4个独立噬菌体克隆 ,其中 phage 3和 phage 6有较多重复克隆存在 ,为优势克隆 ;Westernblot分析显示 ,筛库血清中特异性IgE抗体能有效识别各噬菌体克隆。分别用各克隆噬菌体免疫小鼠 ,均能诱导特异性IgE抗体产生。结论　从 12肽噬菌体表面显示肽库中成功筛选到日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位。     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa重组抗原对小鼠免疫保护性的初步研究

目的：为研究日本血吸虫（中国大陆株）22．6kDa抗原的免疫保护性。方法：将其编码cDNA经PCR扩增后亚克隆入载体质粒PGEX—1λt进行表达，并用重组抗原免疫了一批昆明鼠。结果：与对照组相比，重组抗原免疫小鼠获得了38．93％的减虫率。结论：证明重组的日本血吸虫22．6kDa抗原可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

日本血吸虫重组线粒体相关蛋白免疫学活性鉴定

分子筛进一步纯化并复性的融合蛋白均能刺激家兔产生特异性抗体 ,粗提包涵体蛋白免疫家兔 ,血清抗体滴度为 1∶2 5 6 0 0 ,复性蛋白及经分子筛纯化的蛋白免疫的家兔血清抗体滴度均为 1∶5 12 0 0 ,Westernblot结果显示 ,粗提包涵体蛋白、复性蛋白及经过分子筛进一步纯化并复性的蛋白均能被重感染兔血清和rSj338/2 6GST特异性免疫兔血清所识别。攻击实验中 ,粗提包涵体蛋白和经分子筛纯化的蛋白分别可诱导小鼠产生 2 7.8% (P <0 .0 1)和 30 .4 % (P <0 .0 1)的减虫率 ,4 0 .4 % (P <0 .0 1)和 4 3.5 % (P <0 .0 1)肝总减卵率。粗提包涵体蛋白中rSj338和经分子筛纯化的蛋白中rSj338分别可诱导小鼠产生 13.9% (P <0 .0 5 )和 2 0 .0 % (P <0 .0 5 )的减虫率 ,30 .0 % (P <0 .0 1)和 4 1.7% (P <0 .0 1)肝总减卵率。结论　获得的日本血吸虫线粒体相关的重组融合蛋白(rSj338/2 6GST)具有良好的免疫学活性 ,重组融合蛋白 (rSj338/2 6GST)及rSj338均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴诱导C57BL/6 小鼠皮肤早期免疫应答动态变化的研究

目的观察紫外线辐照致弱日本血吸虫尾蚴经耳廓免疫C57BL/6小鼠后,小鼠皮肤组织早期免疫应答的动态变化.方法 98只小鼠测定双侧耳廓厚度后,14只作为0 d组不感染/免疫,其余平均分为2组.一组经双侧耳廓分别感染正常尾蚴150 条/耳, 另一组经双侧耳廓分别免疫紫外线辐照致弱尾蚴150条/耳.感染/免疫后第1、2、4、7、14、21天分别剖杀2组小鼠各7只,测定耳廓厚度.取感染处的耳廓组织,左侧进行培养,收集上清检测相应细胞因子.右侧纵切为二,一半进行HE染色观察炎症反应;另一半应用免疫组化技术观察皮肤组织中IL-12和CD11c分子的表达.结果正常尾蚴感染的小鼠皮肤炎症反应在第7天达到高峰后逐渐下降,第21天基本恢复;而辐照尾蚴免疫小鼠耳廓皮肤在第14天炎症反应才达高峰,第21天反应仍然十分强烈.尾蚴穿皮后第4天,组织中有较高水平的CD11c及IL-12分子表达.皮片培养细胞因子定量检测也显示：与Th1细胞应答相关的IL-12、IFN-γ及Th2型因子IL-10早期在正常、辐照尾蚴差异无显著性.结论和正常尾蚴相比,辐照致弱尾蚴诱导的皮肤免疫应答持续时间长、强度高,但两者诱导Th细胞向不同方向极化并不发生于免疫应答启动阶段.     

达到血吸虫病传播阻断标准10年后人群病情监测和评价

目的探讨达到血吸虫病传播阻断标准(以下简称达标)10年后人群血吸虫病病情,评价其防治效果和今后防治策略。方法对达标10年地区采用ELISA法检测人群血清抗血吸虫抗体水平,并用改良Kato-Katz法粪检血吸虫卵,进行定量观察和比较。结果达标10年地区人群粪检未查到血吸虫虫卵(0/3440),血清抗血吸虫抗体阳性率为3.50%(132/3770),男性和女性分别为4.36%(78/1788)和2.72%(54/1982),人群抗血吸虫抗体OD均值为0.068±0.056,其中男性为0.072±0.058,女性为0.065±0.054,前者显著高于后者(P<0.01);6~20岁,21~35岁,36~50岁和51~65岁年龄组抗血吸虫抗体阳性率分别为0.33%(2/609)、0.55%(4/731)、3.79%(53/1399)和7.08%(73/1031),抗血吸虫抗体OD均值分别为0.048±0.030、0.052±0.032、0.071±0.060和0.087±0.068,除6~20岁与21~35岁年龄组在抗体阳性率和抗体OD均值方面无显著性差异外(P>0.05),其余各年龄组抗体水平在统计学上均有非常显著性差异(P<0.01)。结论达标10年地区人群血吸虫病情稳定,未发现粪检阳性病人,但人群抗血吸虫抗体水平消减缓慢,在一定时期仍长期存在,且不同性别及年龄人群抗体水平仍与其暴露于原危险因素的机率有关,建议在加强输入性传染源和钉螺监测的同时加强对历史病人的清查和治疗。     

HPV-11 E7重组腺病毒体外转染树突细胞对其功能的影响

目的 研究腺病毒载体介导HPV-11 E7基因转染树突细胞(DC)对其表型和功能的影响。方法 用最佳感染滴度(MOI)重组腺病毒pAD-E7转染成熟DC,流式细胞仪检测转染前后DC表型变化,并用~3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖的能力及ELISA检测DC、T细胞共同培养上清中细胞因子的水平。结果 MOI 100为pAD-E7转染DC最佳滴度,pAD-E7转染成熟DC前后对细胞表面的特征性表型CD1a、CD83及CD40、HLA-DR无影响,转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,能刺激T细胞分泌大量IFN-γ、IL-12。结论 pAD-E7转染成熟DC对其功能无明显影响,转染后的DC与T细胞共孵育能诱导T细胞向Th1细胞极化。     

日本血吸虫22.6kDa膜相关蛋白Th1型表位的免疫学鉴定

目的鉴定日本血吸虫22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）的Th1型表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法采用合成肽Sj22.6-P4、无关肽（对照）及PBS免疫C57BL/6小鼠2次（间隔7 d）,末次免疫后7～10 d取脾分离单个核细胞,用合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS刺激培养,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞培养上清中IFNγ-、IL-4及IL-2水平。运用流式细胞技术三色标记法检测经合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS免疫2次的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞内的Th1、Th2细胞因子。结果合成肽Sj22.6-P4可刺激经该抗原肽免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,与PBS组相比,增殖指数（SI）均〉2。与无关肽对照组相比,细胞培养上清中IL-2、IFN-γ分泌水平增高,其中IL-2分泌水平差异有统计学意义（P〈0.05）,IFN-γ差异无统计学意义（P〉0.05）,而IL-4分泌水平明显降低（P〈0.05）。合成肽Sj22.6-P4免疫组小鼠脾脏CD4＋T细胞中分泌IFN-γ细胞的百分比显著增高,分泌IL-4细胞的百分比显著降低（P均〈0.05）。结论合成肽Sj22.6-P4是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。     

两种参数估计方法在ELISA检测结果标准化中的应用(英文)

目的探讨在运用改良光密度值标准化方法进行的ELISA检测结果标准化过程中,两种不同参数估计方法对标准化结果造成的差异。方法标准化公式中的参数估计分别采用线性最小二乘法和非线性最小二乘法中的高斯牛顿迭代法。结果通过线性最小二乘估计得到的标准曲线很大程度上由浓度较低的几个点所决定,而非线性最小二乘法确定的标准曲线总体上更接近实验数据,真实体现了不同实验板的反应动力学特性。结论非线性最小二乘法更适用于标准化过程中的参数估计,有效降低了检测结果在板间的变异。