实验技术人员与时俱进提高自身素质体会

科学实验是推动社会进步,创造人类文明的一项重要活动.在科教兴国的战略思想指导下,我国的科学技术飞速发展,实验技术员的文化基础也有了提高,并从过去的洗洗涮涮、开关仪器等实验前后的准备和收拾那种简单重复工作中解放了出来.但实验技术员是教学科研辅助人员的性质仍然没有变,只是有了新的更高的职责：在努力提高自身素质做好教学科研的同时还要参与实验室的综合管理,将自己的素质提高与实际工作有机地结合起来.     

日本血吸虫(中国大陆株)虫卵cDNA文库的构建

应用定向克隆方法，将日本血吸虫虫卵ｃＤＮＡ片段重组入噬菌体载体λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ的ＥｃｏＲⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切位点之间。所构建的基因表达文库的容量为１．０７×１０７重组子。经含有ＩＰＴＧ及Ｘ－Ｇａｌ的颜色选择平皿测定，初步提示重组效率达１００％。     

日本血吸虫病血清学诊断数据变换的新方法

目的建立一种日本血吸虫病血清学诊断数据变换的方法。方法血吸虫抗体检测试剂盒检测来自两个现场的血清，并通过I-ODST法进行标准化。使用Stata软件进行统计分析。结果在对诊断数据进行变换前，日本血吸虫病阴性人群与阳性人群抗体水平都不服从正态分布，变换后阳性人群抗体水平服从正态分布，阴性人群抗体水平仍不服从正态分布。因此，考虑对诊断数据作统一变换，使得阳性人群抗体水平服从正态分布，再利用正态分布性质，以阳性人群的抗体水平分布值作为基础确定血清学诊断的临界值。结论本研究建立了一种日本血吸虫病血清学诊断数据变换的方法，使得阳性人群抗体水平服从正态分布，同时提出以阳性人群为基础确定诊断临界值的构想。     

胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及鉴定

目的:构建及鉴定胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区(mIA-2i)和IgGFc嵌合蛋白的真核表达载体pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc。方法:实验于2004-09/2005-07在南京医科大学病原生物学系完成。①采用反转录-聚合酶链反应方法从ICR小鼠的脑组织和脾脏中分别扩增胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区(mIA-2i)和IgGFc段(mIgGFc),并引入相应的酶切位点(XhoⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/EcoRI)。②分别将扩增后的片段克隆入pUCm-T质粒,通过XhoⅠ/BamHⅠ双酶切和连接后,获得pUCm-T/mIA-2i-mIgGFc重组质粒。③经过XhoⅠ/EcoRI双酶切后,将融合基因mIA-2i-mIgGFc克隆入真核表达载体pEGFP-N2。通过酶切、聚合酶链反应及插入片段序列测定对重组质粒pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc进行鉴定。结果:①从ICR鼠的脑组织和脾脏中反转录-聚合酶链反应获得胰岛细胞瘤相关蛋白2胞内区和IgGFc段。②通过基因工程操作,获得重组克隆质粒pUCm-T/mIA-2i和pUCm-T/mIgGFc,并经酶切鉴定克隆成功。③获得重组克隆质粒pUCm-T/mIA-2i-mIgGFc,经聚合酶链反应和双位点酶切鉴定重组成功。④获得重组质粒pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc和pEGFP-N2/mIA-2i,经聚合酶链反应、酶切及测序鉴定证实特异性片断插入真核表达载体成功。结论:pEGFP-N2/mIA-2i-mIgGFc真核表达载体的构建,为利用胰岛细胞瘤相关蛋白2基因疫苗预防非肥胖性糖尿病小鼠发生自身免疫性糖尿病的研究奠定了基础。     

糖尿病的基因治疗技术：大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

目的：构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒pCMV／proinsulin并进行序列测定。方法：实验选用雄性SD大鼠1只，从大鼠胰腺组织中提取总RNA，通过RT-PCR法获得胰岛素原基因cDNA全长序列，并采用现代分子生物学技术，借助真核细胞表达质粒pCMV-Script vector具有多克隆酶切位点的特点，选择适当的限制性酶切位点(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)，并使大鼠胰岛素原基因cDNA两端带有相同的酶切位点，利用其黏性末端进行定向克隆，从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒pCMV上。结果：经RT-PCR法扩增并通过DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因。经PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子，并进一步进行DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法)，确定其序列与目的基因序列完全一致。结论：成功构建重组质粒pCMV／proinsulin，为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞，使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础。     

日本血吸虫病流行区人群吡喹酮治疗前后细胞因子水平的研究

目的　观察日本血吸虫病流行区人群的细胞免疫应答状态及吡喹酮治疗对其影响。方法　采集日本血吸虫病流行区12 9人 (粪检阳性者 6 4例 ,粪检阴性者 6 5例 ) ,吡喹酮治疗前及治疗后 45 d的静脉血 ,以血吸虫成虫和虫卵抗原分别刺激诱生细胞因子 ,检测培养上清中的细胞因子 IL- 5、IL- 10和 IFN- γ水平。结果　 12 9例中 ,对血吸虫抗原刺激诱生的细胞因子水平粪检阴性组明显高于粪检阳性组 ;治疗后 ,细胞因子诱生水平较治疗前显著升高 ,特别是 IL- 5和 IFN- γ。结论　流行区人群的细胞免疫应答显示总体下调趋势 ;吡喹酮治疗后出现细胞因子水平的明显升高     

中国血吸虫病防治策略优化组合的回顾与评估

我国血吸虫病流行于长江流域及其以南的12个省（市、自治区）,至今已有2000多年历史,危害严重。新中国成立后,在中央和疫区各级政府高度重视下,历经50余年积极防治,成就卓著。截至2005年底,已有广东、广西、福建、浙江和上海5个省（市、自治区）及263个县（市、区）达到了血吸虫病传播阻断标准,64个县（市、区）达到了血吸虫病传播控制标准。     

重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建基因工程菌株,获得重组蛋白Sj-FABPc(日本血吸虫脂肪酸结合蛋白).方法用PCR法从日本血吸虫cDNA文库中扩增Sj-FABPc基因片段,再将该片段重组于pGEMT中并进行DNA测序鉴定,经酶切后将目的片段构建成重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc,转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionTM Protease酶对融合蛋白进行分离,获得纯化的14kDa Sj-FABPc.SDSPAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定.结果获得pGEX-6P-1/Sj-FABPc菌株,分离纯化出14kDa Sj-FABPc,表达量为10.52mg/L.Western blot显示,表达蛋白能被日本血吸虫免疫兔血清识别.结论重组蛋白Sj-FABPc可高效表达并有良好的抗原性.     

重组副肌球蛋白联合ISA206佐剂诱导抗日本血吸虫保护力

目的探讨重组的全长日本血吸虫副肌球蛋白（rSj97）的免疫保护作用以及作为疫苗的适用佐剂组合。方法重组副肌球蛋白分别与弗氏佐剂（rSj97-FA）、ISA206（rSj97-ISA206）、CpGODN（rSj97-CpGODN—IFA）联合免疫C57BL／6小鼠,在0、2、4周共进行3次免疫注射,剂量为每只每次25μg rSj97。第3次免疫后2周,经腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴（40±2）条。第12周剖杀冲虫,计算减虫率与减卵率。同时,在0、2、6、8、12周对各组小鼠采血,检测血清中特异性IgG1与IgG2a抗体。结果相对于未免疫组,rSj97-FA组的减虫率为27．6％、减卵率为-2．3％,rSj97-ISA206组的减虫率为45．3％（P〈0．01）、减卵率为35．4％（P〈0．05）,rSj97-CpGODN—IFA组的减虫率为7．3％、减卵率为6．4％,对照组（仅注射CpGODN）减虫率为13％、减卵率为3％。rSj97-FA、rSj97-ISA206与rsj97-CpGODN—IFA组在首次免疫后2周,rsj97特异性IgG1与IgG2a水平较免疫前显著升高（P〈0．01）,攻击感染后仍维持在同一水平;对照组与未免疫对照组,其特异性IgG1水平至感染后6周方显著升高（P〈0．01）,但仍为较低水平（A值〈0．1）,而IgG2a一直保持在基线水平,无显著变化。结论重组副肌球蛋白分别与3种佐剂联合使用均能诱导小鼠产生特异性IgG1和IgG2a,但仅ISA206佐剂组诱导C57BL／6小鼠产生显著的抗日本血吸虫保护力,rSj97-ISA206是潜在用于大动物免疫的疫苗组合。     

南京市儿童医院门诊儿童隐孢子虫病的流行病学调查

目的调查南京市儿童医院门诊儿童隐孢子虫病的流行情况,进而了解2008年夏秋季节南京及周边地区儿童人群中隐孢子虫病的流行情况。方法收集2008年7～8月份和9～10月份两个时间段南京市儿童医院门诊儿童粪样,用改良抗酸染色和金胺酚-改良抗酸复合染色法,检查粪样中的隐孢子虫卵囊。同时,随机收集部分门诊儿童的血样,通过分子生物学技术纯化特异性隐孢子虫重组蛋白SA35,用微粒子免疫检测法检测血清中抗SA35IgG抗体水平。结果共收集儿童医院门诊儿童的粪样2268份,血样207份。粪样隐孢子虫检出率为0.97%,血检结果阳性率为29.95%,经卡方检验,粪检和血检的阳性率在性别之间差异无统计学意义(P>0.05);但血检阳性率1岁以上的儿童比1岁以内的儿童明显增高(P<0.05)。结论南京及周边地区门诊儿童在夏秋季仍然存在隐孢子虫感染,需要进一步加强血检以监控隐孢子虫病的传播。