健脾消癌方通过PI3K/Akt信号通路抑制结肠癌血管生成的研究＊

目的 观察结肠癌HCT116细胞健脾消癌方的条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响，从PI3K/Akt生物轴调控角度探讨其作用机制。方法 培养HCT116细胞，细胞设3组：对照组，健脾消癌方组（加入15%健脾消癌方含药血清）及人参皂苷Rg3组；制备HCT116细胞健脾消癌方条件培养液（分组及制备方法见实验方法），用条件培养液干预HUVEC（脐静脉内皮细胞，Human Umbilical Vein Endothelial Cells），Matrigel基质胶法检测HCT116细胞健脾消癌方条件培养液对HUVEC小管形成的影响。随后采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组HCT116细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、VEGF（血管内皮生长因子，Vascular endothelial growth factor）蛋白表达。最后在结肠癌HCT116荷瘤小鼠中验证健脾消癌方对肿瘤生长速度的影响，并经瘤组织VEGF蛋白表达、CD31免疫组化染色检测肿瘤内血管生成情况。结果 模型组HUVEC细胞管腔形成较空白血清组显著增加（P<0.05）；健脾消癌方组及人参皂苷Rg3组较模型组HUVEC细胞管腔形成显著减少（P<0.01）。p-Akt和VEGF蛋白表达水平模型组高于空白血清组（P<0.05），健脾消癌方组及人参皂苷Rg3组显著低于模型组（P<0.01）；PI3K、Akt蛋白表达量组间差异无统计学意义。与对照组比较，模型组荷瘤小鼠肿瘤体积显著性增大，瘤组织内VEGF表达、CD31阳性面积显著性增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，健脾消癌方组及人参皂苷Rg3组荷瘤小鼠肿瘤体积显著减小，瘤组织内VEGF表达、CD31阳性面积降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 健脾消癌方可抑制肿瘤的血管生成和生长，其作用机制可能与PI3K/Akt生物轴调控VEGF表达有关。     

COX20基因变异线粒体复合物Ⅳ缺乏症相关的遗传性周围神经病4例病例系列报告及文献复习

背景：原发性线粒体病具有高度的临床和遗传异质性，其中周围神经是线粒体病的常见受累器官之一。 目的：总结COX20基因变异相关周围神经病的临床表型及遗传学特征。 设计：病例系列报告。 方法：回顾性收集2018年5月至2020年5月复旦大学附属儿科医院诊治的COX20基因变异相关周围神经病患儿的临床资料，总结其临床表现、基因检测结果及治疗效果，并以“COX20”、“线粒体复合物Ⅳ缺乏症（Complex Ⅳ deficiency）”为关键词检索中英文数据库。检索时间均为从建库至2021年12月。总结已报道COX20基因变异与临床表型的关系。 主要结局指标：临床表型和COX20基因变异位点。 结果：4例患儿纳入分析，男、女各2例，其中3例自幼运动发育落后。4例均在儿童期起病，均以行走不稳为首发症状。肌电图均提示多发性周围神经损害改变，感觉神经轴索受累为主。4例患儿均携带COX20基因复合杂合变异，包括错义变异2个，无义变异和移码变异各1个，其中移码变异c.262delG(p.E88Kfs*35)尚未见报道。文献复习目前共报道COX基因变异18个家系22例患儿（包括本文病例）,起病中位年龄为5（1.0~17）岁，22例均以行走困难或步态不稳起病，11例（50.0%）有精神运动发育迟滞，病程中14例(63.6%)出现构音障碍，14例(63.6%)出现肌力下降和/或足部畸形，8例（36.4%）出现共济失调，6例(27.3%)出现肌张力障碍，5例（22.7%）存在认知倒退等。21例患儿行神经传导及肌电图检查，19例(90.5%)提示多发性周围神经病变。头颅（18例）及脊髓（10例）MR检查提示，脊髓萎缩4例（40%），小脑萎缩4例（22.2%）。9例患儿已无法独立行走，丧失独立行走能力中位年龄为10（7~21）岁。目前共报道9个变异位点，4种变异类型，其中错义变异5个，剪切变异2个，无义变异和移码变异各1个。 结论：COX20基因变异患者多早期起病，以周围神经系统病变为主要表现，可合并构音障碍、共济失调、肌张力障碍、认知倒退等，病情逐渐进展，致残率高。COX20基因变异类型以错义变异最常见。     

基于网络药理学探讨搜风愈喘方拆方“祛宿痰方”调控儿童哮喘的作用机制＊

目的 基于“伏风暗瘀宿痰”小儿哮喘病机新说，采用网络药理学及实验验证的方法，探索搜风愈喘方拆方“祛宿痰方”治疗儿童哮喘的作用机制，验证中医“宿痰”病机与西医细胞外基质改变病理之间的交通性。方法 通过TCMSP数据库建立“祛宿痰方”的有效成分和靶点数据集，利用OMIM、GeneCards、DrugBank、TTD疾病数据库建立哮喘疾病靶点数据集，利用Cytoscape软件取交集并构建“祛宿痰方”与哮喘的蛋白质互作网络，筛选关键靶点蛋白。利用Metascape数据库进行基因本体（Gene ontology，GO）分析以及京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。复制卵蛋白（OVA）诱导的哮喘大鼠模型，对核心通路及关键靶点进行实验验证。结果 共得到“祛宿痰方”治疗哮喘的靶点98个，包括IL-13、TP53、TGF-β1、VEGF-A、MMP9等，KEGG得到与哮喘相关的通路287条（P＜0.05），包括NF-κB信号通路、PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路等。GO结果显示与哮喘相关生物进程包括炎症反应、细胞外基质调控、氧化应激、血管生成等。动物实验证实“祛宿痰方”可下调大鼠肺组织中p-NF-κB-P65磷酸化水平，抑制NF-κB信号通路的激活，降低IL-13、TGF-β1 mRNA表达量（P<0.05），减少哮喘大鼠肺组织中炎症细胞浸润、黏液产生，从而延缓哮喘的进程。结论 “祛宿痰方”可抑制NF-κB信号通路的激活，降低肺组织中IL-13、TGF-β1 mRNA表达量，可能通过抑制炎症反应、调控细胞外基质等途径作用于哮喘，中医“宿痰”病机与西医细胞外基质改变病理之间存在一定的的交通性。     

过氧化物酶体增殖物激活受体基因甲基化与子痫前期的相关性分析

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)基因启动子的甲基化水平及基因表达情况与子痫前期之间的相关性。方法选取2016年11月-2017年8月在甘肃省妇幼保健院产科分娩的67例子痫前期患者为观察组,56例正常分娩产妇为对照组。应用甲基化特异度聚合酶链反应(MSP)法和RT-PCR技术分析PPARα基因启动子区Cp G位点的甲基化水平及其mRNA表达情况。结果观察组患者外周血和胎盘组织PPARα基因63位点的甲基化程度明显低于对照组,差异均有统计学意义(均P0. 05)。观察组患者胎盘的PPARα基因mRNA表达量明显高于对照组,其外周血中蛋白浓度也显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P0. 05)。胎盘组织和外周血的甲基化率呈显著正相关关系(r=0. 84,P0. 01)。结论 PPARα基因启动子区域Cp G位点低甲基化变化与子痫前期具有相关性。子痫前期发病可能与母体自身密切相关。     

健脾益肾方对非小细胞肺癌细胞体外增殖凋亡作用的实验研究

目的:探讨健脾益肾方对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞体外增殖凋亡的作用。方法:人NSCLC细胞系A549分为四组:空白对照组(仅加入细胞培养液)、阴性对照组(加入细胞,不进行中药处理)、实验组(加细胞加中药处理)。荧光定量PCR和Western blot分别检测Survivin、Bcl-2和Caspase-3的mRNA和蛋白表达。MTT检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与空白对照组相比,阴性对照组细胞在24、48、72 h的吸光度值明显升高,细胞凋亡率下降,Survivin和Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量上调,Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量下调,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);而健脾益肾方处理的实验组24、48、72 h的吸光度值均显著降低,细胞凋亡率显著上升,Survivin和Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量下调,Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量上调,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:健脾益肾方可通过下调Survivin和Bcl-2、上调Caspase-3表达诱导NSCLC细胞凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖,进而抑制NSCLC的发展。     

基于NF-κB通路的芒果苷干预脂多糖诱导的细胞炎症作用机制研究

目的研究芒果苷对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法采用脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞炎症模型。实验分四步:(1)细胞存活率实验分5组,即:空白组、LPS组、LPS+不同浓度(50、100、150μg/mL)芒果苷组。MTT法检测细胞存活率。(2)一氧化氮(NO)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白介素6(IL-6)分泌实验分6组,即:空白组、LPS组、LPS和不同浓度芒果苷(50、100、150μg/mL)组、LPS+BAY 11-7082[核因子κB(NF-κB)抑制剂]组。Griess法检测NO分泌量,ELISA法检测IL-1β、TNF-α及IL-6分泌量。(3)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与环氧化酶-2(COX-2)mRNA及蛋白表达实验分组同细胞存活率实验。实时荧光定量PCR检测iNOS及COX-2 mRNA水平变化,Western blot检测iNOS及COX-2蛋白表达水平。(4)细胞质、细胞核中NF-κB表达实验分3组,即:空白组、LPS组、LPS+150μg/mL(终末浓度)芒果苷共处理组, Western blot检测细胞质、细胞核中NF-κB p65蛋白表达量。结果 (1)与空白组比较,LPS组显著降低RAW264.7细胞存活率(P0.05);与LPS组比较,50～150μg/mL芒果苷预处理对RAW264.7细胞增殖无显著影响(P0.05)。(2)与空白组比较,LPS组NO、IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量显著升高(P0.05);与LPS组比较,除50μg/mL芒果苷预处理组NO、TNF-α分泌量无显著变化外(P0.05),其余各组NO、IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量均显著降低(P0.05)。(3)与空白组比较,LPS组iNOS、COX-2 mRNA及蛋白表达量均显著升高(P0.05);与LPS组比较,50～150μg/mL芒果苷预处理组iNOS、COX-2 mRNA及蛋白表达显著下降(P0.05)。(4)与空白组比较,LPS组细胞质中NF-κB p65蛋白量减少,细胞核中则增多(P0.05);与LPS组比较,150μg/mL芒果苷预处理组细胞质中NF-κB p65蛋白量升高,细胞核中蛋白量减少(P0.05)。结论芒果苷可能通过抑制NF-κB信号通路,而抑制iNOS、COX-2表达及相关炎症因子的分泌,干预LPS诱导的RAW264.7细胞炎症。     

乳腺癌组织中miR-34a表达与新辅助化疗疗效、肿瘤病理特征、细胞增殖基因的相关性

目的研究乳腺癌组织中miR-34a表达与新辅助化疗疗效、肿瘤病理特征、细胞增殖基因的相关性。方法选取2013年5月-2017年2月在台州市中西医结合医院接受新辅助化疗的乳腺癌患者作为研究对象,收集乳腺癌组织及癌旁组织,测定miR-34a及细胞增殖基因的表达水平,判断化疗的近期疗效及远期疗效。结果乳腺癌组织中miR-34a的表达水平明显低于癌旁组织,Ki-67、PCNA、Cyclin D1的阳性表达率明显高于癌旁组织(P0. 05)。TNMⅢ期乳腺癌组织中miR-34a的表达水平明显低于TNMⅠ～Ⅱ期乳腺癌组织(P0. 05),淋巴结浸润乳腺癌组织中miR-34a的表达水平明显低于无淋巴结浸润的乳腺癌组织(P0. 05)。乳腺癌组织中miR-34a高表达患者的治疗有效率、疾病控制率明显高于miR-34a低表达患者,无进展生存情况优于miR-34a低表达患者(P0. 05)。miR-34a高表达的乳腺癌组织中Ki-67、PCNA、Cyclin D1的阳性表达率明显低于miR-34a低表达的乳腺癌组织(P0. 05)。结论乳腺癌组织中miR-34a高表达患者的新辅助化疗效果更为理想,细胞增殖基因的表达更低。     

lncRNA ABHD11-AS1通过调控STAT1/STAT3表达促进非小细胞肺癌细胞增殖与迁移

  目的   探讨lncRNA ABHD11-AS1在非小细胞肺癌中的生物学功能和作用机制。  方法   选取2016年7月至2018年12月在广东医科大学附属医院行非小细胞肺癌手术的248例患者，采用χ2检验分析lncRNA ABHD11-AS1的表达与患者年龄、性别、临床病理分期、病理类型及吸烟状态的关系；采用Kaplan-Meier法分析ABHD11-AS1对非小细胞肺癌患者的预后意义；应用qRTPCR方法检测ABHD11-AS1在非小细胞肺癌组织和细胞系中的表达；通过体外功能测定评估敲低ABHD11-AS1对细胞增殖和转移的影响；通过Western blot实验探讨ABHD11-AS1在非小细胞肺癌中致癌作用的分子机制。  结果   lncRNA ABHD11-AS1高表达组较低表达组吸烟患者较少（P=0.02），分期更晚（P < 0.01）；ABHD11-AS1高表达预示非小细胞肺癌患者预后不良；ABHD11-AS1在非小细胞肺癌组织和癌细胞株中高表达；敲低ABHD11-AS1的表达可抑制体外细胞增殖和迁移；敲低ABHD11-AS1表达抑制STAT1和STAT3癌蛋白的表达。  结论   ABHD11-AS1可能通过促进STAT1和STAT3癌蛋白的表达，从而增加非小细胞肺癌细胞的增殖、集落形成以及迁移和侵袭能力。