层黏连蛋白及其整合素受体在肝窦毛细血管化时的协调表达

目的：探讨层黏连蛋白（LN）及其整合素受体在肝窦毛血管化时的协调表达。方法：皮下注射四氯化碳制备大鼠肝纤维化模型,取肝组织用扫描电镜、特殊染色等进行病理组织形态学观察;层黏连蛋白及其整合素受体α6斑点免疫印迹研究。结果：动态观察了肝纤维化的特征病理变化;肝窦毛细血管化,即窗孔消失,基底膜形成及表型改变。LN在肝纤维化各期窦周阳性着色面积分别为0、1．902％、6．02％、9．68％、14．14％,其差异有显著性（P＜0．001）;正常时α6在肝窦内皮细胞（SEC）上无表达,肝窦毛细血管化时SEC出现α6表达与LN在窦周沉积一致,α6在纤维化时组织中含量明显高于正常（P＜0．05）。结论：LN于肝纤维经时在肝组织中不断沉积,并沿肝窦壁形成基底膜,使肝窦毛细血管化,且SEC出现LN整合素受体的诱导表达。提示LN及其整合素受体的协调表达在肝窦毛细血管化及肝纤维化的发病机制中有着重要的作用。     

肿瘤生长因子β1及血小板衍生生长因子对肝窦内皮细胞整合素α631及黏着斑激酶表达的影响

目的观察肿瘤生长因子β1(TGFβ1)及血小板衍生生长因子(PDGF)对大鼠肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cell,SEC)整合素α6β1表达及黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)活性的影响.方法用胶原酶原位灌注、Percoll不连续密度梯度离心法分离大鼠SEC,并进行体外培养.采用细胞-ELISA和免疫沉淀蛋白质酪氨酸激酶活性测定法,分别观察TGFβ1及PDGF对SEC表面整合素α6β1表达及FAK活性的影响.结果经TGFβ1及PDGF作用24 h后,α6β1蛋白表达明显强于对照组(P＜0.05),且呈剂量依赖性.作用至48 h,表达继续增强,细胞中FAK的活性也明显增高(P＜0.05),虽于48 h后回落,但仍明显高于对照组.结论 TGFβ1及PDGF可促进SEC表面整合素α6β1的表达及FAK活性增高,可能是它们参与肝纤维化发生的机制之一.     

高糖及血管紧张素Ⅱ对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见而且严重的慢性并发症,高血糖和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是导致DN肾纤维化最主要的两种物质,它们通过共同的信号传导途径参与了肾纤维化的发生发展[1,2].近年来,国外研究发现结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对肾细胞增殖、表型改变及细胞外基质(ECM)具有较强调控作用,其异常表达在DN肾纤维化进程中起了重要作用.本研究拟用高糖和AngⅡ刺激体外培养的系膜细胞,测定其CTGF mRNA的表达情况,以探讨高糖和AngⅡ对系膜细胞CTGF水平变化的影响.     

肿瘤坏死因子α对肝星状细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的研究肿瘤坏死因子（ＴＮＦ α）对肝星状细胞（ ＨＳＣ）结缔组织生长因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ, ＣＴＧＦ）表达的影响。方法用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注, Ｎｙｃｏｄｅｎｚ一步密度梯度离心法分离正常大鼠 ＨＳＣ,并用 ＴＮＦ α,转化生长因子β １（ＴＧＦ β１）处理细胞;应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）技术分别观察不同培养时期的ＨＳＣ中的ＣＴＧＦ的表达。结果 ＴＮＦα, ＴＧＦβ１均诱导ＨＳＣ的ＣＴＧＦ表达; １０μｇ／Ｌ浓度的 ＴＮＦα作用 ６ｈ,没有观察到 ＨＳＣ表达 ＣＴＧＦ;作用 ２４ ｈ后,检测到有 ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ的表达。 ＴＧＦ β１在 １μｇ／Ｌ浓度作用 ６ｈ后,即可诱导 ＨＳＣ的 ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ表达。结论 ＴＮＦ α可诱导 ＨＳＣ的 ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ表达,可能是其参与早期肝纤维化形成的作用机理之一。     

生脉注射液对阻塞性黄疸术后炎症介质及肾功能作用的研究

目的：观察生脉注射液对阻塞性黄疸（阻黄）术后炎症介质及肾功能的作用。方法：阻黄及非黄疸的肝外科患者分三组,术后给予一般治疗阻黄（OJ）组、非黄疸（NON－LJ）组及生脉注射液治疗阻黄组。动态观察血浆炎症介质内毒（LPs）、肿瘤坏死因子（TNF－α）、白细胞介素－6,8（IL－6,IL－8）、内皮素（ET）以及肾脏功能指标尿转铁蛋白（TFR）、尿白蛋白（ALB）及尿视黄醇（RBP）的变化。结果：生脉主射液治疗组术后7天与术后1天相比,LPs、IL－6、IL－8、ET、TNF－α、TFR、RBP、ALB明显下降（P＜0．05）,且低于或接近术前水平,黄疸对照组在术后7天与术后1天相比无显著差异（P＞0．05）。结论：生脉注射液对阻黄患者术后LPs有拮抗作用,同时降低其它炎症介质水平,另外 具有保护肾脏功能的作用。     

如何建立成年大鼠心肌细胞钙超载模型

目的探讨建立成年大鼠心肌细胞钙超载模型的方法。方法Langendorff灌流,分离钙耐受成年大鼠心肌细胞,采用不同浓度钙离子导入剂-伊屋诺霉素(ionomycin)作用心肌细胞1小时,用荧光分光光度计测定心肌细胞内的游离钙浓度。结果1.分离的活性心肌细胞比率约70~80%,杆状、横纹清晰。2.实验组1(iono-mycin0.5μmol/L)心肌细胞[Ca2 ]1明显高于对照组(282.07±25.19vs115±21.21nmol/L,P<0.05);实验组2(ionomycin1.0μmol/L)心肌细胞[Ca2 ]1(376.35±29.44)显著高于正常对照组(P<0.05)。结论通过本方法可以建立成年大鼠心肌细胞钙超载模型。     

TGFβ1反义寡核苷酸对大鼠肝脏星状细胞激活及其胶原生成的抑制作用

为探讨 TGFβ1 反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotides,ASON)对大鼠肝脏星状细胞活化及其胶原生成的作用 ,作者合成了特异性的 TGFβ1 硫代磷酸 ASON及其对照 (正义 ,错义寡核苷酸 ) ,并将其加入至培养的肝脏星状细胞中。通过细胞免疫化学方法分析 α- SMA的表达来观察肝脏星状细胞的活化 ,肝脏星状细胞产生TGFβ的水平用生物学方法测定 ,以 3H-脯氨酸掺入抑制率的测定观察胶原生成的变化。结果 :针对 TGFβ1 m RNA转译起始区的 ASON在终浓度为 1 0 μm ol/ L 时 ,能明显地抑制体外培养的肝脏星状细胞的激活、TGFβ1 的产生及其胶原的生成能力 ,而对照组寡核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。上述结果表明 ,ASON对肝脏星状细胞无损伤作用。 TGFβ1 ASON可能成为一种潜在的抗肝纤维化治疗的药物。     

不同剪切速率下同型半胱氨酸对胶原诱导血小板活化的影响

观察同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY)对胶原诱导血小板活化及其信号途径的影响.浓缩血小板或洗涤血小板在37℃与不同浓度的HCY孵育后,应用血小板聚集仪或流室系统分别测定HCY对胶原诱导血小板的聚集及黏附的作用.采用免疫沉淀-Western Blotting实验来观察Src激酶及PLCγ2酪氨酸磷酸化水平变化.结果发现(1)在10～100μM浓度范围内,HCY能明显增强Ⅰ型胶原诱导的洗涤血小板的聚集反应.(2)在低剪切速率(100/s)时,较高浓度(50及100μM)的HCY能明显促进血小板黏附到胶原上;而较低浓度(10及25μM)的HCY却没有此作用.在高剪切速率(1 600/s)时,10～100 μM浓度的HCY对血小板黏附到胶原上的能力没有影响.(3)HCY能使Ⅰ型胶原刺激导致的Src激酶及PLCγ2的酪氨酸磷酸化水平更加升高;而整合素β1的封闭抗体能部分降低HCY的刺激作用.体外研究表明,HCY能协同促进胶原诱导的血小板活化反应,而且是通过它与血小板表面胶原受体之间相互作用,导致了GPVI(glycoprotein Ⅵ)及整合素α2β1信号途径的激活,包括Src激酶及PLCγ2.     

内脂素对大鼠肝星状细胞表达碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的 观察内脂素对大鼠肝星状细胞(HSCs)表达碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)的影响,探讨内脂素在肝纤维化中的作用.方法 对培养激活的大鼠HSCs分别给予不同浓度(0、50、100和200 ng/mL)的内脂素进行刺激,在不同时限(6 h、12 h、24 h及36 h)收集细胞总RNA.用实时荧光定量(SYBR Green Ⅰ)RT-PCR检测FGF-2 mRNA的表达.结果 50 ng/mL内脂素孵育HSCs 24 h可上调FGF-2 mRNA的表达(1.71±0.34 vs.1,P＜0.05),随着刺激浓度的增加FGF-2 mRNA的表达进一步上调(P＜0.05).100 ng/mL内脂素孵育HSCs 12h可促进FGF-2 mRNA的表达(1.68±0.31 vs.1,P＜0.05),随着刺激时间的延长,FGF-2 mRNA的表达逐渐增加(P＜0.05).结论 内脂素能诱导大鼠HSCs表达FGF-2,提示内脂索可能通过诱导FGF-2的表达参与肝纤维化的发病过程.