蟾蜍灵对人胃癌细胞系MGc-803的细胞毒作用

蟾蜍灵(bufalin)是我国传统中药蟾酥中蟾毒的主要成分之一,研究其抑癌作用及机制具有重要意义。采用台盼蓝染色法、噻唑蓝还原法和光镜观察bufalin对人低分化胃腺癌细胞系MGc—803的生长抑制作用。结果显示,0．01μmol／L及以上浓度bufalin对MGc—803细胞具有显著的抑制作用,IC50值约为0．1μmol／L。bufalin抑制MGc—803生长的机制是致使细胞核染色质凝缩、碎裂,DNA损伤,胞浆RNA含量下降,导致细胞死亡。     

RP—HPLC法测定大鼠血清中蟾蜍灵浓度

目的:建立反相高效液相色谱法测定大鼠血清中蟾蜍灵浓度。方法:血清样品用乙醚-乙酸乙酯(5:1)提取两次,40℃水浴氮气吹干,残留物用甲醇溶解后进样。色谱柱为Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×150mm,5 μm),流动相为甲醇-水(70:30),流速1.0 mL·min～1,紫外检测波长298 nm,柱箱温度30℃。内标物为华蟾酥毒基。结果:本法最低检测浓度为0.05μg·mL～1,线性范围为0.1-1.6μg·mL-1,r=0.9977。日内精密度RSD小于4％,日间RSD小于10％,蟾蜍灵的萃取回收率为84.0％。结论:本法快速、准确、灵敏,可用于蟾蜍灵的体内药物动力学研究。     

蟾蜍灵诱导人急性淋巴白血病细胞凋亡的实验研究

目的研究蟾蜍灵对人急性淋巴白血病(CEM)细胞的作用。方法台盼蓝拒染法观察蟾蜍灵对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测蟾蜍灵作用后细胞凋亡情况。结果10~80nmol/L蟾蜍灵于24h开始明显抑制CEM细胞生长(P<0.01)。24,48和72h抑制细胞增殖50%的药物浓度分别为15.13,9.59和6.57nmol/L;20nmol/L,40nmol/L蟾蜍灵作用24h后出现典型的细胞凋亡形态学改变;20nmol/L蟾蜍灵处理12,24和48h凋亡细胞百分率分别为2.46%、17.92%和66.26%;40nmol/L蟾蜍灵处理12,24和48h凋亡细胞百分率分别为5.19%、32.71%和80%以上;凋亡细胞百分率呈剂量和时间依赖性。结论蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制CEM细胞生长、诱导凋亡。     

HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物

目的建立HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物(和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基)的方法。方法采用ODS-2(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.15%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1 mL/min,柱温40℃,检测波长296 nm。HPLC-MS联用的色谱条件与HPLC分离基本条件一致,流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液。通过电喷雾离子源,正离子模式扫描,对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物进行分析鉴别。结果 9种蟾蜍二烯内酯类化合物均得到良好分离,线性关系良好(r≥0.999 6)。加样回收率均在92%~105%,RSD5%。应用建立的HPLC-MS方法测定了10批六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物的量,分别为和蟾蜍他灵0.40~0.88 mg/g,沙蟾毒精0.32~0.83 mg/g,远华蟾毒精0.61~2.11 mg/g,去乙酰华蟾毒它灵0.15~0.32 mg/g,蟾毒它灵0.84~1.85 mg/g,华蟾毒它灵25.76~62.14 mg/g,蟾毒灵0.96~2.06 mg/g,华蟾酥毒基2.30~4.75 mg/g,脂蟾毒配基1.20~2.61 mg/g。结论所建立的定量测定方法简便、快速、准确可靠,专属性强,可用于六神丸的质量控制。     

蟾蜍灵诱导人胃癌细胞凋亡的实验研究

用ＭＴＴ法、形态学观察法、ＤＮＡ电泳和流式细胞仪观察蟾蜍灵（Ｂｕｆａｌｉｎ）诱导的胃癌细胞凋亡。结果表明,０．０１ｕｍｏｌ／Ｌ蟾蜍灵作用ＭＧｃ－８０３细胞４８ｈ,即可显著抑制细胞生长,ＩＣ５０值约为０．１ｕｍｏｌ／Ｌ。琼脂糖凝胶电泳获得梯形图谱,汉式细胞仪ＤＮＡ直方图上出现典型的亚二倍体峰,凋亡主要发生在Ｇ１／Ｇ０期,细胞凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而增高,以上结果提示,ｂｕｆａｌｉｎ对胃癌细     

麝香保心丸中蟾酥的质量控制标准提升

目的:建立麝香保心丸中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量测定的一测多评法,为完善麝香保心丸国家标准提供检测方法。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)建立麝香保心丸中3种蟾毒配基含量的同步测定方法,并进行方法学验证,色谱条件为Nucleosil 100-5 C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.1%磷酸二氢钾水溶液(磷酸调节pH 3.2)(48∶52),流速0.6 mL·min^-1,检测波长296 nm,柱温35℃;以华蟾酥毒基为内参物,建立其对蟾毒灵和脂蟾毒配基的相对校正因子,并对相对校正因子的关键影响因素进行考察,采用相对保留时间进行待测色谱峰定位,结合在线紫外光谱和超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法(UPLC-QTOF/MS)提供的精确相对分子质量辅助识别待测色谱峰;采用外标法验证一测多评法测定结果的准确性。结果:建立了麝香保心丸中3种蟾毒配基的一测多评质量评价模式,华蟾酥毒基对蟾毒灵和脂蟾毒配基的相对校正因子分别为0.922和1.01;11批样品中三者总量范围33.7~36.0μg/丸,外标法和一测多评法测定结果无显著性差异。结论:建立的方法可用于麝香保心丸中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的质量控制,建议麝香保心丸国家标准含量测定项下蟾酥药材的质量控制新增蟾毒灵,并以这3种成分总量制定含量限度值。     

蟾蜍灵对高糖诱导大鼠系膜细胞过表达纤维连接蛋白和结缔组织生长因子的影响

目的:观察不同浓度蟾蜍灵对高糖诱导的大鼠系膜细胞(MC)过表达FN及CTGF的影响,拟探讨其防治糖尿病肾病的可能作用?方法:体外培养MC,将细胞分为5组:正常对照组?高糖组?高糖 + 低浓度蟾蜍灵(5 × 10-9 mol/L)组?高糖 + 中浓度蟾蜍灵(5 × 10-8 mol/L)?高糖+高浓度蟾蜍灵组(5 × 10-7 mol/L)?以台盘兰拒染法检测蟾蜍灵对MC的毒性作用,48 h后,采用RT-PCR法和Western-blot法检测各组MC中FN?CTGF mRNA和CTGF蛋白的表达及其变化?结果:蟾蜍灵在5 × 10-9 ~5 × 10-7 mol/L浓度间对MC无明显细胞毒作用?48 h后,与对照组相比,高糖组CTGF mRNA和蛋白以及FN mRNA表达均显著增加(P < 0.05);高?中?低浓度蟾蜍灵干预能显著降低高糖诱导的上述指标表达,且呈浓度依赖效应(P < 0.05)?结论:蟾蜍灵能部分抑制高糖诱导的MC过表达FN,呈浓度依赖效应,其作用可能部分是通过降低促纤维化因子CTGF合成而实现,提示蟾蜍灵在DN纤维化防治领域具有进一步研究的价值?     

蟾酥中3种脂溶性有效成分提取工艺及含量测定方法

目的:优化蟾酥中脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的提取工艺,并建立了测定蟾酥提取物中上述3种成分含量的HPLC方法。方法:以蟾酥中脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基含量为指标,采用L9(34)正交试验对蟾酥提取工艺进行了优化;建立的HPLC法,Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(55:45),流速1.0mL.min-1,检测波长296 nm。结果:最佳提取工艺条件为A2B3C3D2,即75倍量95%乙醇80℃提取120 min;所建立的HPLC方法蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分离,且重现性、精密度、线性关系良好,最小检测限分别为14.6,9.0,11.8ng.mL-1。结论:确定了蟾酥最佳提取条件,HPLC能准确测定蟾酥提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的含量,方法简便,结果准确。     

蟾蜍灵对食管癌ECA109细胞凋亡的影响及机制探讨

目的 观察蟾蜍灵对食管癌ECA109细胞凋亡的影响并探讨其机制.方法 MTT法检测蟾蜍灵对细胞的增殖抑制作用;流式细胞术分析细胞凋亡情况;Western-Blot法检测凋亡抑制蛋白survivin,caspeas-3蛋白的表达.结果 随着蟾蜍灵浓度及作用时间的增加,细胞存活率逐渐降低(P＜0.05),细胞凋亡率明显增高(P＜0.05);随着药物浓度增加,survivin蛋白表达逐渐下降,同时活化caspase-3.结论 蟾蜍灵可诱导食管癌ECA109细胞凋亡,其机制可能与抑制survivin蛋白和活化caspase-3有关.     

抑制NF—κB通路增强蟾蜍灵诱导的HL-60细胞凋亡

目的：观察蟾蜍灵对HL-60细胞活力和凋亡的影响,对NF—κB通路的作用,探讨NF—KB通路在蟾蜍灵诱导HL-60细胞凋亡过程中的作用。方法：锥虫蓝染色检测细胞活力;流式细胞仪技术检测细胞凋亡和周期分布;采用WesternBlot技术检测IKK的磷酸化。结果：蟾蜍灵以时间和剂量依赖性方式诱导HL-60细胞凋亡。24,48和72h抑制细胞活力的Ic50浓度分别为26．3,7．8和2．0nmol／L。对照组HL-60细胞有pIKK表达,蟾蜍灵可诱导IKK的快速活化。NF—κB通路的特异性抑制剂Bay11—7082增强蟾蜍灵的凋亡诱导作用。结论：蟾蜍灵可诱导HL-60细胞凋亡,促进IKK活化与NF—κB通路调节相关,而且与NF—κB通路抑制剂有协同作用。