Notch1蛋白在胚胎干细胞向神经细胞诱导分化过程中的表达

背景:胚胎干细胞是体内各种成熟细胞的"种子"细胞,是神经移植和发育基因功能研究的有利工具.Notch1信号足多种神经细胞有序分化的关键性调控通路,目前对其在胚胎干细胞诱导分化过程中的动态表达尚无报道.目的:探讨胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化过程中,跨膜信号分子Notch1蛋向的表达.设计、时间及地点:细胞观察,于2003-10/2004-10在中山大学中山眼科中心完成.材料:中山大学实验动物中心自建BALB/C小鼠胚胎干细胞Ⅵ株,具备XY染色体,正常核型比例80%以上,由中山大学中山眼科中心黄冰教授惠赠.方法:胚胎干细胞复苏后,加入含20%胎牛血清、106 IU/L小鼠白血病抑制因子的高糖DMEM细胞培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中,两三天常规消化传代.向传至11代的胚胎干细胞中加入含20%胎牛血清、5×10-7mol/L维甲酸的高糖DMEM诱导分化培养基,设立诱导1,5,9d 3个观察时间点.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞形态变化.免疫荧光化学检测成熟神经元标志性抗原MAP-2的表达.免疫细胞化学、Western Blot法及流式细胞术检测Notch1蛋白的表达.结果:胚胎干细胞呈克隆样生长,至诱导第9天大部分克隆周围为单一密集的神经网络.随着诱导时间延长,胚胎干细胞分化出的MAP-2阳性神经细胞数逐渐增多.胚胎干细胞克隆内的细胞几乎均呈Notch1强阳性或刚性表达,诱导分化后Notch1蛋白的表达随时间延长而逐渐降低(P<0.01).结论:在胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化过程中,Notch1信号逐渐关闭,提示Notch1可能对胚胎干细胞向神经细胞的特异性分化起重要作用.     

外环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

目的:研究外环境对骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)定向分化成心肌样细胞的影响。方法:取SD大鼠骨髓,通过贴壁法进行MSCs培养,经过多次传代后获得较纯的MSCs。用5-氮胞苷进行诱导分化,显微镜下观察其形态变化,通过RT-PCR鉴定心肌特异基因心房利尿肽和脑钠肽表达。实验分Ⅰ组为在玻片上的5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;Ⅱ组为5-氮胞苷干预的MSCs;Ⅲ组为玻片上未用5-氮胞苷干预的MSCs移入到心肌细胞培养环境中;Ⅳ组为未用5-氮胞苷干预的MSCs。显微镜下观察4组形态变化,并通过免疫组化鉴别结蛋白和心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)表达及其出现时间的早晚。结果:RT-PCR显示诱导6周后有心房利钠肽,脑钠肽的表达。Ⅱ组MSCs诱导后10d可见细胞由原来扁平多角形变成长梭状,15d后部分细胞胞体明显增粗,可见到有些细胞间有融合样情况发生,20d左右类似肌管样细胞出现;而Ⅰ组在17d左右可以看到类似肌管样细胞;Ⅲ,Ⅳ组未见上述形态改变。免疫组化表明Ⅲ,Ⅳ组未见阳性细胞出现;Ⅰ,Ⅱ组可见阳性结果,且Ⅰ组阳性结果出现的比Ⅱ组更早。结论:MSCs在体外的化学诱导物条件下可以诱导分化成心肌样细胞,心肌细胞培养环境对其定向分化成心肌样细胞有促进作用。     

WT1基因转染抑制白血病细胞生长和集落形成并促进细胞分化

WT1基因的先天性缺失或功能缺陷可以导致Wilms瘤 ,因此普遍被认为是一种抑癌基因 ,但其在白血病发病中的作用尚有争论[1,2 ] 。我们应用逆转录病毒载体将WT1基因cDNA导入两种不同的人白血病细胞系K5 6 2和U937细胞并获得过度表达 ,发现WT1转染白血病细胞的生长和集落形成能力降低 ,对分化诱导剂的敏感性增加 ,支持该基因在白血病发病中的抑癌基因说。现将结果报道如下。材料和方法1　细胞培养　K5 6 2细胞和U937细胞 (购自美国ATCC)用含10 %胎牛血清的RPMI 16 40培养液 (Gibco/BRL)培养 ,双嗜性包装细胞PhoenixAmpho(NolanLab ,…     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景：肌源性干细胞是一种成体多能干细胞，已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点，临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的：探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法，为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计：重复观察测量。单位：武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料：实验于2003-12／2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只，XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸（Sigma公司），dispase酶（Gibco公司），鸡胚提取液（自制）。方法：①将大鼠以质量浓度为10异／L的戊巴比妥钠30s／ks腹腔麻醉后，无菌条件下取腓肠肌，置人冷DMEM培养基中，D—Hank’s液洗涤组织块，除去筋膜、肌腱、神经和血管。剪成1．0-3．0mm^3小块，移入离心管。向组织中加入0．2％XI型胶原酶及0．1％的胰酶。采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中孵育1h，未贴壁细胞移人新的培养瓶中，加入新的培养基37℃培养1h后，未贴壁细胞再次转瓶换液，37℃培养过夜，如此反复，每次间隔24h转瓶换液，培养第5-6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70％融合后，胰蛋白酶消化，以1：2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基，24h后制备细胞爬片，采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标：肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果：①肌源性干细胞的形态观察：从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形，折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形，48h后贴壁完全并开始增生，细胞逐渐延展成梭形或纺锤形，有两极，体积小。随培养时间的延长，细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果：细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光。阳性率达90％。结论：肌原性干细胞属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点O高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取．免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

人脐血单个核细胞体外分化为神经细胞

目的　探讨核转录因子 (NF) κB配体受体激动因子 (receptoractivatorofNF KappaBligand ,RANKL)和脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)体外诱导人脐血细胞 (humanum bilicalcordbloodcells,HUCBC)分化为神经元和神经胶质细胞的可行性。方法　采集足月妊娠、正常分娩的新鲜脐血 ,取单个核细胞 (MNC) ,利用人可溶性NF κB配体受体激动因子 (sRANKL)、BDNF作为分化诱导因子进行体外诱导 ,维甲酸 (RA)诱导分化作为对照 ,倒置显微镜动态观察细胞生长、分化情况 ;培养 10d后 ,应用免疫细胞化学染色法检测培养细胞的胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)和神经元特异核蛋白 (NeuN)表达情况 ,进行细胞性质鉴定。结果　诱导分化 10d后 ,RANKL、BDNF和BDNF +RANKL组的NeuN阳性细胞数分别为 (97.0± 13.5 )个 ,(85 .0± 5 .6 )个 ,(16 7.0± 19 7)个 ,分别是对照组 [(5 5 .7±8.5 )个 ]的 1.7,1.5 ,3.0倍 ,GFAP阳性细胞数分别为 114 .7± 18.0 ,2 33.3± 2 1.7,2 89.0± 2 4 .9,分别是对照组的 1.4 ,2 .9,3.6倍。RANKL向神经元方向诱导分化的作用与BDNF相当 ,向神经胶质细胞分化的作用不及BDNF。RANKL和BDNF对HUCBC向神经细胞分化具有协同作用 ,二者联合应用明显促进HUCBC向神经元和神经胶质细胞分化     

三氧化矿物凝聚体对牙乳头细胞增殖和分化影响的实验研究

目的 研究不同质量浓度的三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)对大鼠牙乳头细胞(rat dental papilla cells,RDPC)增殖和分化能力的影响,探讨MTA在根尖诱导方面的作用.方法 组织块法原代培养RDPC并鉴定.制备不同质量浓度的MTA浸提液(0.002、0.02、0.2、2及20 g/L)并处理第3代RDPC 3 d,以普通培养液的RDPC作为空白对照组(每组6孔),用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞增殖能力,筛选最适合细胞生长的质量浓度.用0.002 g/L MTA培养RDPC,以普通培养液的RDPC作为空白对照组,检测1、3、5、7 d RDPC的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和1、3、5 d RDPC的Ⅰ型胶原含量.用方差分析对不同浓度MTA干预后RDPC的增殖能力进行统计学分析,用t检验对0.002 g/L MTA干预后RDPC分泌的ALP活性和Ⅰ型胶原含量进行统计学分析.结果 MTT法检测不同质量浓度MTA对RDPC增殖能力影响中,培养3d后的A值20 g/L组(0.092±0.011)显著低于空白对照组(0.249±0.006),差异有统计学意义(P＜0.01)；0.02和0.002 g/L组的A值(分别为0.267±0.005、0.276±0.006)均显著高于空白对照组(0.249±0.006),差异均有统计学意义(P＜0.01).ALP活性检测结果显示,MTA组3、5、7d的A值[分别为(0.217 ±0.008)、(0.253±0.005)和(0.279±0.004)]均显著高于空白对照组相应时间点的A值[分别为(0.166±0.006)、(0.221±0.006)、(0.242±0.004)],差异均有统计学意义(P＜0.01).3、5d的Ⅰ型胶原含量MTA组[分别为(78.46±2.72)、(90.73±3.08) μg/L]均显著高于相应时间点的空白对照组[分别为(66.75±3.08)、(74.27±3.50) μg/L],差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 高浓度的MTA抑制RDPC的生长,低浓度的MTA可以促进RDPC的增殖和分化.     

树突状细胞的研究进展

树突状细胞（DC）是一类来源于骨髓造血系统的异质性细胞,它是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M.Steinman于1973年发现的,是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞（APC）。在过去的十几年中,许多科研人员将研究重点放在DC的起源、分化和生物学特性,并且证实DC在先天性免疫、适应性免疫和维持自身组织免疫耐受的过程中起着非常关键的作用,应用DC的高效抗原呈递作用衍生而来的过继性免疫疗法逐渐应用于抗肿瘤以及治疗各种感染性疾病。