EXPRESSION OF VEGF RECEPTOR KDR IN DIFFERENT ORIGINATED CARCINOMAS

Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｓｔｈｅｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｏｆｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ．１Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｏｆｔｕｍｏｒｐｒｏｇｒｅｓｉｏｎ，ｔｕｍｏｒｃｅｌｓｃａｎｓｅｃｒｅｔｅｖａｒｉｏｕｓａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓ...     

SARS冠状病毒半胱氨酸蛋白酶3CLpro的克隆表达及分离纯化

SARS（严重急性呼吸综合征）是由一种新型的人类冠状病毒引起的。由于SARS冠状病毒3CL蛋白酶在病毒的复制翻译中起关键作用，所以成为抗SARS药物设计的关键靶标之一。该研究中，利用以pET28a为载体的高效原核表达系统，克隆表达出SARS冠状病毒3CL蛋白酶，然后由NTA-Ni^2＋亲和层析柱对表达的蛋白进行分离纯化。3CL蛋白酶在大肠杆菌表达系统中的成功表达为今后进一步筛选抗SARS病毒药物奠定基础。     

肿瘤坏死因子受体-1在甲状腺癌中的表达及其意义

目的:研究肿瘤坏死因子受体1(tumornercosisfactorreceptors1,TNFR1)在甲状腺癌组织中的表达及其与临床及病理因素的关系。方法:应用免疫组织化学SP法和显微图像分析技术检测41例甲状腺癌中TNFR1的表达,并与9例甲状腺腺瘤及7例腺瘤旁形态学正常的甲状腺组织作对照。结果:①甲状腺癌组织中TNFR1的表达水平显著高于腺瘤组及正常甲状腺组(P<0.001),而在甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织中的表达水平无显著性差异(P>0.05)。②在甲状腺癌各临床病理参数中,TNFR1的表达只与病理类型有关,在乳头状癌组中的表达水平高于滤泡状癌组(P<0.05);而与年龄、性别、肿瘤大小、浸润程度及淋巴结转移等因素无关(P>0.05)。结论:TNFR1参与了甲状腺癌的发生发展过程,可以作为甲状腺癌诊断与鉴别诊断的病理学指标之一,但不能作为评估甲状腺癌生物学行为和预后的有关指标。     

氧化砷对结肠癌细胞凋亡的诱导及机制的探讨

目的 探讨氧化砷(As2O3)对人结肠癌细胞的凋亡诱导作用及其分子机制。方法应用显微镜和流式细胞仪观察As2o3对SW480细胞株的形态学改变和诱发凋亡率；免疫组化技术检测bcl-2、Fas、二种基因编码蛋白的表达。结果 As2O3作用于细胞后，可看到较典型的细胞凋亡形态学改变。AO／EB荧光染色法显示，细胞凋亡率为2．1％～10．6％。As2O3诱导SW480细胞凋亡作用呈时间和浓度依赖性。流式细胞仪DNA直方图上呈现典型的亚二倍体凋亡峰。As2O3主要作用于细胞周期的G2／M期。经As2O3作用的SW480细胞bcl-2基因编码蛋白表达减少，Fas基因编码蛋白表达增加。结论 As2O3有诱导SW480细胞凋亡作用，其诱导细胞凋亡的分子机制可能是下调bcl-2基因编码蛋白表达，增强Fas基因编码蛋白表达。     

血管内皮生长因子在急性白血病细胞株的表达

目的 　探讨血管内皮生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受体 (VEGFR)KDR ,Flt - 1在急性白血病细胞株NB4、K56 2、HEL ,Jurkat、HL - 6 0 ,THP的基因表达情况 ,为进一步研究急性白血病治疗的抗肿瘤靶点提供思路。方法　采用RT -PCR和酶联免疫吸附法 ,对 6种急性白血病细胞系肿瘤细胞进行VEGF及其受体的基因型和表型检测。结果 　 6种白血病细胞系均 ( 1 0 0 % )检测到VEGF基因表达 ,强度不同 ,其中 3种细胞株 ( 50 % )检测到受体Flt- 1基因表达 ,所有细胞株均未检测到受体KDR基因表达 ;6种急性白血病细胞株上清液中VEGF浓度都明显高于对照。结论 　VEGF及其受体在白血病细胞表达 ,说明VEGF及其受体在白血病的发生、发展中起重要作用 ,是急性白血病特征之一。     

IL-15cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的建立转人白细胞介素-15(hIL-15)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-15的表达情况。方法将携带人白细胞介素-15的质粒pcDNA3.1( )-hIL-15转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Westernblot和ELISA法对hIL-15的表达进行检测。结果IL-15基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达。RT-PCR电泳结果显示hIL-15基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-15的含量为(185.0±12.2)pg/ml,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-15。结论hIL-15基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达。     

KAI1基因在食管癌组织中的表达及其意义

目的:探讨KA I l基因的表达与食管癌发生及浸润转移的关系。方法:采用RT-PCR及免疫组化方法,检测食管癌组织及其正常粘膜中KA I lmRNA及蛋白的表达。结果:KA I lmRNA的表达在食管癌组织和其正常粘膜中未见显著性差异,且与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移无关;KA I l蛋白在癌组织中的表达明显低于其正常粘膜,在有淋巴结转移病例中的表达明显低于无淋巴结转移病例,但与肿瘤的分化程度、浸润深度无关。结论:食管癌癌变和转移可能与KM I1蛋白的低表达有关,但与KA I lmRNA的表达无关,推测这可能是由于翻译后修饰所致。     

铜绿假单胞菌Quorum-Sensing系统中rhlR基因的克隆表达及其免疫保护性研究

目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。