小鼠B7-H3对T细胞的体外正性协同刺激作用

小鼠B7-H3作为协同刺激分子的生物学功能至今尚未明确.本文拟通过构建小鼠B7-H3基因的真核表达载体,获取稳定表达小鼠B7-H3基因的细胞株,并进一步通过体外实验研究其对T淋巴细胞体外活化及功能的调节作用.作者运用RT-PCR技术从小鼠肝脏组织中获得全长小鼠B7-H3基因,并构建真核表达载体pIRES2-B7-H3,...     

SD近交系大鼠经电子直线加速器照射后局部与全身自由基的变化

目的探讨直线加速器放射损伤后自由基的改变情况。方法采用直线加速器照射制作动物模型,同时观察其血清及局部组织中NOS、MDA、SOD、GSH-PX含量的改变。结果电子直线加速器照射后MDA、NOS在一定剂量范围内上升;SOD、GSH-PX则在一定剂量范围内下降。结论电子直线加速器照射后能产生自由基,并引起自由基清除酶系活性下降,但局部变化明显小于全身变化,这些改变是否可能为引起胶原损伤的原因,有待进一步研究。     

人类β3GnT8/β3GalT7对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用

目的探讨人类β1,3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8/β3半乳糖基转移酶7（β3GnT8/β3GalT7）与人4IgB7-H3蛋白的相互作用,以期阐明该糖基转移酶对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用。方法在线预测软件预测人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的糖基转移酶作用位点;免疫共沉淀探讨β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白的相互结合作用;细胞免疫荧光化学技术研究两种蛋白质在细胞内的空间定位。结果人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的N-糖基化位点共有8个,O-β-GlcNAc的附着位置共有18个;β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白能相互结合而被共沉淀;两种蛋白质能在人肺癌A549细胞中共定位。结论人类β3GnT8/β3GalT7可能对人4IgB7-H3蛋白有糖基化修饰作用。     

一株新的鼠抗人2IgB7-H3功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

研制功能性鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体。以人2IgB7-H3基因转染细胞L929/2IgB7-H3为免疫原,常规免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠;利用B淋巴杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,L929/2IgB7-H3细胞为抗原筛选阳性细胞;经间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞进行反复筛选和多次克隆化培养;采用快速定性试纸法鉴定单抗Ig亚类;利用竞争抑制性实验分析该单抗识别的抗原表位;采用MTT法分析该单抗在体外阻断DC对T细胞的促增殖效应。结果:获得了1株持续稳定分泌鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7D7),该单抗可特异识别L929/2IgB7-H3分子和介导有效的共刺激信号。该单抗的成功获得和其生物学特性的初步鉴定,为进一步研究B7-H3两个异构体在DC细胞及肿瘤细胞上的作用机制奠定了物质基础。     

B7-H3单抗交联作用对Mo-DC体外生物学功能的影响

探讨B7-H3分子对人外周血单核细胞来源树突状细胞(Mo-DC)体外成熟和生物学功能的影响。采用常规方法从健康人外周血单核细胞诱导DC,在诱导过程中,加入B7-H3单抗21D4共培养,经流式细胞术检测Mo-DC上B7-H3分子和其他共刺激分子的表达,ELISA试剂盒检测培养上清中细胞因子IL-10和IFN-γ的分泌量,并采用3H-TdR掺入法测定T细胞的增殖。结果:B7-H3分子在未成熟和成熟Mo-DC上均有高水平表达,抗人B7-H3单抗21D4能上调Mo-DC表面CD80、CD86和CD83的表达,提高Mo-DC的共刺激能力,促进T细胞的体外增殖,并能显著促进T细胞分泌IL-10。由此表明,B7-H3单抗21D4交联作用可以促进Mo-DC体外成熟,上调其共刺激T细胞的能力。     

电子直线加速器照射对NIH 3T3细胞的细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨电子直线加速器照射对细胞周期及细胞凋亡的影响。方法 采用直线加速器对NIH 3T3细胞进行照射，观察细胞周期及细胞凋亡的改变情况；同时测定损伤前后p53蛋白的表达情况。结果 照射后细胞凋亡数增加，p53蛋白表达量上升。结论 电子直线加速器照射损伤可诱导细胞凋亡。     

β射线放射损伤后MDA和SOD的变化

目的 探讨β射线放射损伤后MDA和SOD的改变情况。方法 采用直线加速器照射制作动物β射线损伤模型。同时对NIH3T3细胞进行β射线外照射。观察MDA、SOD含量的改变。结果 β射线损伤后,MDA在一定剂量范围内上升;SOD则在一定剂量范围内下降。结论 β射线损伤后能产生自由基,但其作用效应主要在全身,自由基在受照局部皮肤组织中改变不大。     

β射线放射损伤后胶原代谢的变化

目的 探讨β射线放射损伤后胶原代谢的改变情况。方法 采用直线加速器照射制作动物的β射线损伤模型,同时对ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行β射线外照射,观察胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的改变;观察胶原降解酶ＭＭＰｓ－１活性变化;同时测定损伤后细胞因子ＴＧＦ－β１、ＩＬ－６的变化情况。结果 β射线损伤后胶原总量变化不大,而Ⅰ型胶原含量下降,Ⅲ型胶原含量上升;ＮＭＰｓ－１活性上升;ＴＧＦ－β１、ＩＬ－６表达量增加。结论     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。