长期体外培养条件下海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的变化

目的:了解在体外长期培养的条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的形态及其细胞活率的变化。方法:实验于2003-09/2004-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学室完成。①材料:细胞为牛肾上腺嗜铬细胞;海藻酸钠和多聚赖氨酸由SIGMA公司提供;DMEM-H培养液由GIBCO公司提供;加强型小牛血清由HYCLONE公司提供。②方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微胶囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,以含有体积分数为0.1的小牛血清的DMEM-H培养基培养于CO2孵箱中,定期换液。③观察指标:在光学显微镜下观察微囊及囊内细胞的形态;以锥虫蓝染色法计数囊内细胞的数量和存活率,观察时间为8个月以上。结果:①微囊包裹后1d时,光镜下见微囊呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内为单个细胞,均匀散在分布。体外培养35d时,微囊仍呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内细胞聚集成体积较小的团块。体外培养240d时,微囊形态无明显变化;囊内大部分细胞已聚集成多个体积较大的团块,少数微囊内的细胞聚集成一个大的细胞团。②随着培养时间的延长,囊内细胞数量逐渐减少,从最初的(54±10)个/囊减少到培养243d时的(35±7)个/囊,但差异无显著性意义(P>0.05);囊内细胞的活率无明显改变,开始为95%,到培养243d时仍有93%的细胞存活。结论:在体外培养条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞可较长时间地保持良好状态。     

海藻酸钙微球与海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹对不同种类细胞生长的影响

目的：观察海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹对不同特性细胞生长的影响。方法：实验于2004-04／2005-04在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成。细胞：牛肾上腺嗜铬细胞、Swiss小鼠胚胎成纤维细胞株（3T3）、人早幼粒白血病细胞株。仪器和试剂：加拿大Sun氏静电微囊发生仪；体视显微镜；海藻酸钠，聚赖氨酸、氯化钙、柠檬酸钠。制备海藻酸钙微球和海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊，分别用其包裹3T3细胞、牛肾上腺嗜铬细胞及人早幼粒白血病细胞。按照细胞的不同及包裹材料的不同，分为裸细胞组、海藻酸钙微球组、海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊组。在光镜下观察体外培养的微球、微囊及细胞的形态、存活率、增殖率。细胞增殖率=培养后细胞数-培养前细胞数／培养前细胞数&;#215;100％。结果：光镜下见包裹后即刻海藻酸钙微球和海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊呈大小均一的半透明圆球，直径150-300μm，表面光滑。培养24h时，牛肾上腺嗜铬细胞、3T3或人早幼粒白血病细胞均呈单个细胞，均匀分散于微球或微囊内。培养120h时，牛肾上腺嗜铬细胞、3T3和人早幼粒白血病细胞在海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内聚集成团块，而在海藻酸钙微球内仍呈单个细胞散在分布。①海藻酸钙微球或海藻酸钙～聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内高增殖活性的3T3或人早幼粒白血病细胞的存活率显著高于牛肾上腺嗜铬细胞（74．38&;#177;7．72，89D8&;#177;3．05，87．48&;#177;3．43，92．40&;#177;7．56，72．67&;#177;2．08，89．33&;#177;5．13，P〈0．01）；海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内细胞存活率均显著高于海藻酸钙微球内同一种细胞的存活率（87．88&;#177;38,89．08&;#177;3．05，89．63&;#177;5．55，85．33&;#177;4．86,92．40&;#177;7．56，95．08&;#177;3．81，83．67&;#177;5．51，89．33&;#177;5．13，85．33&;#177;2．08，P〈0．01）。②在不同状态下，培养72和120h时，人早幼粒白血病细胞或3T3细胞的增殖率存在差异，海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内同种细胞的增殖率显著高于裸细胞组（2．54&;#177;0.55,5：20&;#177;2．38,2．30&;#177;0．70,2．26&;#177;0．83，3．89&;#177;1．89，13．37&;#177;16．14，P〈0．05）；而在不同状态下牛肾上腺嗜铬细胞的增殖率差异无显著性（P〉0．05）。③在相同状态下，培养72和120h时，人早幼粒白血病细胞增殖率明显高于3T3或牛肾上腺嗜铬细胞（18．66&;#177;7．76，39．11&;#177;16．06，P〈0.01）；而3T3与牛肾上腺嗜铬细胞的增殖率差异无显著性（P〉0．05）。④对同一种细胞，培养24，72和120h时，海藻酸钙微球与海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊相比，其细胞的增殖率差异均无显著性（P〉0．05）。结论：在培养条件下，海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹似更利于该3种细胞的生长；海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹较海藻酸钙微球包裹更利于同种细胞的生长。     

偏侧帕金森病样大鼠脑内微囊化牛嗜铬细胞移植实验

目的:观察偏侧帕金森病样大鼠微囊化牛嗜铬细胞脑移植后多巴胺及其代谢产物含量的变化,探讨大鼠异常旋转行为改善的可能途径。方法:实验于1999-01／12在解放军总医院老年医学研究所完成。选择 6-羟基多巴立体定向损毁右侧黑质诱发的偏侧帕金森病样雌性SD大鼠30只,随机分为2组,微囊组20只,对照组10只。微囊组大鼠水合氯醛麻醉后于右侧纹状体立体定向植入约200个以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠为材料含牛嗜铬细胞的微胶囊,对照组大鼠未做脑内移植手术。观察移植术前后阿朴吗啡(0．5 mg／kg)诱发的大鼠旋转行为。利用微透析技术采取帕金森病样大鼠脑纹状体区细胞外微透析液,用高效液相电化学层析法测定对照组大鼠在6-羟基多巴损毁右侧脑黑质后 16周时及两组大鼠在牛嗜铬细胞移植后12周时脑纹状体区细胞外液中单胺类物质含量的变化。结果:纳入偏侧帕金森病样大鼠30只,实验过程中微囊组麻醉意外、脑出血、肢体癫痫样抽搐死亡4只,对照组脑出血、不明原因死亡2 只。进入结果分析微囊组和对照维分别为16和8只大鼠。①微囊组移植后1周开始阿朴吗啡诱发的异常旋转次数明显减少,作用持续6个月以上(F=37．89,P<0．01)。②对照组帕金森病样大鼠右侧脑黑质损毁后16周时右侧脑纹状体区细胞外液中3,4-二羟基苯乙酸和高香草酸水平较左侧明显降低(t=7．012,4．394,P<0．01),右侧脑上述物质含量仅为左侧脑的8％和12％。③移植后12周,微囊组帕金森病样大鼠右侧脑纹状体区细胞外液中3,4-二羟基苯乙酸、高香草酸和5-羟基吲哚乙酸水平较对照组显著升高(t=4．273,4.402,6．445,P<0．01),分别提高了 3．1,5.3和2．7倍。结论:帕金森病样大鼠黑质损毁侧纹状体区多巴胺类物质含量明显降低, 移植微囊化牛嗜铬细胞后含量升高,使帕金森病样大鼠的运动功能障碍明显改善。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅺ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％—１６％—１４％—９％梯度所获得胰岛的纯度＞９０％。胰岛移植于糖尿病小鼠可使其血糖从移植前的（２６．７０±２．５３）ｍｍｏｌ／Ｌ降低至（１３．９８±３．９２）ｍｍｏｌ／Ｌ，维持２～３ｄ。结论：所改进的制备方法可获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。     

APA微囊包裹对牛肾上腺嗜铬细胞分泌儿茶酚胺和亮氨酸脑啡肽的影响

分析海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包裹对牛肾上腺嗜铬细胞(BCCs)分泌儿茶酚胺(CA)和亮氨酸脑啡肽(L-EK)的影响. 用APA微囊包裹原代BCCs, 分别用高效液相色谱-电化学法和放射免疫法检测囊化与非囊化的BCCs分泌CA和L-EK的能力. 与非囊化BCCs相比, 囊化BCCs在单位时间内分泌肾上腺素(E)和去甲肾上腺素(NE)的能力并没有大的改变, 而多巴胺(DA)和L-EK的分泌量则在部分时间点有明显下降. APA微囊对牛肾上腺嗜铬细胞分泌E和NE并无显著的影响, 而对DA和L-EK的分泌有一定影响, 这种影响仅在包裹后短期内发生, 对后期的分泌没有影响.     

培养于TECA型生物人工肝的猪肝细胞生物转化功能的测定

了解培养于TECA型生物人工肝(BALSS)中猪肝细胞活性和生物转化功能的变化.将新鲜分离的特种猪肝细胞培养于TECA-BALSS的生物反应器中,通过BALSS中空纤维管膜与含盐酸利多卡因的RPMI-1640培养液进行6h交叉灌流.对照组BALSS内无猪肝细胞.采用胎盘蓝染色法测定肝细胞活率.用高压液相法测定利多卡因浓度.结果显示:猪肝细胞在TECA-BALSS中培养6h时,其细胞活率达89.7%;随着交叉灌流时间的增加,其体液环路中的盐酸利多卡因浓度逐步下降,6h时的转化率达80%,显著高于无肝细胞对照组的转化率2.5%(P＜0.01).这表明采用TECA-BALSS可大量的培养猪肝细胞,不仅肝细胞能维持较高的存活率,并能发挥肝细胞的生物转化功能.     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.     

微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞脑内移植治疗偏侧帕金森病样大鼠及猴的实验研究

以右侧帕金森病样大鼠和猴为模型,分别将微囊化和非微囊化牛肾上腺嗜铬细胞（ＢＣＣ）及空微囊定向植入右侧脑纹状体内,观察动物行为、脑组织生化和组织学变化。结果表明：植入的ＢＣＣ能够在异种脑内存活、分泌多巴胺等单胺类物质并纠正帕金森病样大鼠及猴的异常行为。海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠微囊具有免疫保护作用,可明显地延长ＢＣＣ在异种宿主脑内的存活时间,作用超过１０个月。微囊化ＢＣＣ脑内移植有望成为治疗帕金森病的一种有效方法。     

微囊化牛嗜铬细胞移植于帕金森病样大鼠脑纹状体内的行为观察

帕金森病（ＰＤ）的基本病理生理改变是黑质致密带、蓝斑及自主神经节的神经元变性,致使黑质／纹状体通路中的多巴胺（ＤＡ）减少,引起一系列临床症状。目前,由于药物治疗只能部分地改善ＰＤ症状,且不能阻止其病情发展、人们试图在脑内移植ＤＡ能细胞,以替代变性的神...     

远红外热像变化可作为针刺治疗急性周围性面瘫的评价指标

背景：以往实验构建了针刺加远红外热像治疗面瘫,并已证明无论何种证候的面瘫,皆可采用针刺加远红外热像治疗,可明显缩短病程,治愈率高,无任何后遗症。但尚未了解应用远红外热像判断软组织供血状态从而评价病程变化的效果。 目的：动态监测急性周围性面瘫患者针刺治疗前后头面部远红外热像的改变。 方法：正常对照组为接受健康体检者40例,病例组为临床诊断为急性周围性面瘫的患者40例。应用重庆伟联公司生产ATIR-M301B非制冷焦平面医用远红外热像仪(热敏度为0.05 ℃),在环境温度为20~25 ℃的检查室中,采取头、面部远红外热图。采用本机提供的分析软件,分别比较同一受检者针刺治疗前后头面部左、右两侧面颊、内眦、眶上、额及舌区等5个测温区远红外热像的温度差,并行统计学分析。 结果与结论：正常组头面部远红外热像显示面颊、内眦、眶上、额部及舌区5个测温区左、右两侧的温度差异无显著性意义(P > 0.05) 。远红外热像可较好地反映急性周围性面瘫患者针刺治疗前后头面部供血状态的变化,针刺治疗前急性期面瘫侧呈充血性改变,患侧面颊、内眦、眶上、额及舌区5个测温区温度明显高于健侧(P < 0.05~0.001)。针刺治疗后头面部远红外热像显示面颊、内眦、眶上、额部及舌区5个测温区左、右两侧的温度无明显差异(P > 0.05)。表明远红外热像可为临床诊断和治疗急性周围性面瘫提供无创的客观评价指标。 关键词：远红外热像;急性周围性面瘫;针刺疗法;疗效分析;评价指标