中国人胚胎肝组织来源纤溶酶原kringle5基因的克隆与序列分析

目的：分离、克隆和测定中国人纤溶酶原Kringle5功能区基因，为进一步研究其功能奠定基础。方法：实验于2002—06／2003-05在广州医学院金域医学检验中心完成。①实验材料：国人胚肝组织取自广州医学院第一附属医院的流产胚胎（取得家属同意，并经广州医学院第一附属医院伦理委员会批准）。pET21a（＋）载体购自Novagen公司，大肠杆菌BL21（DE3）为医学检验中心保存。引物均由上海生工合成。②实验方法：从国人胚肝组织中提取mRNA，用反转录-聚合酶链反应方法将人纤溶酶原Kringle5的cDNA扩增出来，克隆到pET21a（＋）载体中测序。（D实验评估：采用紫外分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳分析胚肝组织总RNA的抽提结果；经琼脂糖凝胶电泳鉴定Kringle5的反转录-聚合酶链反应扩增结果；pET-Kringle5重组质粒的酶切鉴定；序列测定。结果：①胚肝组织提取总RNA结果：提取的总RNA经紫外分光光度仪测得A260nm/A80nm〉1．8，A60nm，A270nm〉1.2，表明无蛋白残留；电泳结果显示提取的总RNA有明显的28S、18S两条带，说明RNA基本完整。②Kringle5的反转录-聚合酶链反应扩增结果：人Kringle5 cDNA片段长为240bp，加上引物设计的2个酶切位点，总长度为258bp，聚合酶链反应产物长度与该长度一致，符合预期结果。③）pET-Kringle5重组质粒的构建和酶切鉴定结果：用引物所带的限制性内切酶BamH Ⅰ、NdeⅠ双酶切，结果有250bp左右条带出现。④序列测定结果：证实国人纤溶酶原Kringle5功能区基因被成功克隆，序列分析证实为该基因，未发现有基因突变或多态性现象，但第153位核苷酸与文献比较存在碱基替代现象，其组成的密码子由于遗传的简并性，所编码的氨基酸相同，并未造成氨基酸组成的改变。结论：中国人纤溶酶原Kringle5功能区cDNA基因编码序列与国外文献报道的相应序列可能存在碱基替代现象。     

脑性瘫痪儿童的骨代谢生化特点

目的:骨源性碱性磷酸酶与骨钙素在骨的形成过稃中发挥着重要的调节作用,降钙素、甲状旁腺激素是调节体内Ca代谢的重要激素.测定脑性瘫痪患儿血钙、磷、骨源性碱性磷酸酶、骨钙素、降钙素、甲状旁腺激素水平,以了解其骨代谢生化特点及其相关的调控因素.方法:①对象及分组:选择2005-07/2007-07湖南省儿童医院康复中心住院的脑瘫患儿120例为脑瘫组:男82例,女38例;年龄3个月～3岁.按2005年昆明全国脑瘫会议分型标准分为痉挛型印例,不随意运动型印例:按脑瘫程度分为中轻度36例,中度42例,重度42例.同期体检的健康的100名儿童为对照组:男57名,女43名,年龄3个月～3岁.②检测指标及评估:采用全自动分析仪测定两组血清钙、磷水平;用小儿骨源性碱性磷酸酶试剂盒金标法测定骨碱性磷酸酶;用放射免疫吸附法测定骨钙素、降钙素、甲状旁腺激素,并进行两组间、不同程度与类型脑瘫患儿间比较.结果:①脑瘫组忠儿血钙、磷与对照组比较差异无显著性(P＞0.05),骨碱性磷酸酶,骨钙素水平则明显高于对照组(P＜0.01),甲状旁腺激素、降钙素与对照组差异无统计学意义(均P＞0.05).②脑瘫组中痉挛型组血骨钙素与不随意运动型组比较,差异无显著性(P＞0.05),但前者血甲状旁腺激素值高于后者,骨碱性磷酸酶值、降钙素值则低于后者,差异有显著性(均P＜0.05).③重度脑瘫患儿的甲状旁腺激素高于对照组、降钙素低于对照组(均P＜0.01);重度脑瘫患儿骨钙素、甲状旁腺激素值高于轻度和中度(均P＜0.05),降钙素低丁轻度和中度(均P＜0.05).结论:脑瘫患儿血清钙、磷可以通过机体自身血甲状旁腺激素、降钙素调控保持正常,而骨碱性磷酸酶、骨钙素水平升高则提示脑瘫患儿骨矿化不足,骨形成旺盛,骨重建活跃.     

复合壳多糖人工皮肤移植真皮再构建的初步研究

目的：探讨复合壳多糖人工皮肤移植实验家兔后血管和基底膜的形成情况，以了解移植后真皮的再构造情况。方法：别将复合壳多糖人工皮肤移植前、移植后1个月、移植后2个月、正常人皮肤、正常兔皮肤石蜡块切片，用抗第Ⅷ因子多抗及抗层粘连蛋白多抗进行免疫组化染色，观察血管和基底膜的形成情况。结果：合壳多糖人工皮肤移植后1个月及2个月真皮内可见较多新生血管，以移植后1个月明显，且真皮浅层血管数量较正常皮肤多；部分表、真皮交界处层粘连蛋白抗体免疫组化染色阳性，可见不连续的基底膜。结论：复合壳多糖人工皮肤移植实验家兔后真皮再构建良好，是理想的组织工程皮肤材料。     

骨质疏松性椎体骨折模型的建立

目的:建立大鼠的骨质疏松性椎体骨折模型,探讨骨折愈合程度与X射线、骨结构和力学性能的相互关系,以期能为临床治疗提供科学的指导和理论依据。方法:实验于2005-07/2006-07在解放军兰州军区总医院骨研所完成。实验动物:选择雌性SPF级8个月龄SD大鼠54只。实验分组:采用随机数字法将大鼠分为2组:骨质疏松组和对照组,每组27只。实验干预:骨质疏松组经双背侧手术切除卵巢,对照组行伪手术。术后3个月,所有动物麻醉下,采用L5椎体手术开窗刮除术区内松质骨方法建立人工椎体骨折模型。实验评估:于术后1,2,4,6,8,12周观察两组大鼠腰椎影像学、骨组织切片组织学与受累椎体力学性能。结果:54只SD大鼠全部进入结果分析。①影像学观察:术后两组X射线片示L5椎体有一骨折缺损透光区。对照组在术后6周时原透光区与周围骨质无明显差别,而骨质疏松组原透光区仍清晰可见,于8周时无明显差别。②组织学观察:两组软骨细胞在骨愈合1周时出现,形成软骨岛,但骨质疏松组软骨细胞每高倍视野数量明显少于对照组,另外,软骨细胞改建成成熟骨细胞,骨小梁形成数量,胶原纤维排列与对照组比较有显著性差异。③力学性能:在骨质愈合6～12周,L5椎体的最大载荷、弹性模量、最大应力明显低于同期对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:骨质疏松性椎体骨折SD大鼠模型,符合动物模型标准,可用于研究新骨形成与正常骨质结构关系,观察骨质疏松性椎体骨折愈合机制,并证明骨质疏松性松质骨骨折修复过程中,骨折愈合质量降低。     

藻酸钠复合自体软骨细胞修复猪关节软骨缺损的近期效果

目的:采用藻酸钠自体软骨细胞混合物修复猪的关节软骨缺损,观察近期成骨效应。方法:实验于2004-03/2005-04在中山大学附属第二医院实验中心完成。3个月龄的小型猪8只,取其关节软骨进行细胞原代培养,获取原代细胞后,分别进行免疫组织化学法检测细胞Ⅱ型胶原表达。然后对8只小型猪的32个关节进行动物关节缺损的模型建立,每个关节共造3个人工缺损,选择关节左右随机对照。将已经培养好的软骨细胞与已经配制好并消毒的藻酸钠混合,移植到猪的关节软骨缺损处。每只猪关节内注射3个实验点,1个用藻酸钠/细胞混合液为实验组,1个单纯支架材料为单纯材料对照组,1个缺损做空白对照组,模型中缺损区均为关节负重区,胶原纤维绿色(亮绿复染)。修复所用细胞为自体软骨体外培养后,进行移植修复,采用3代体外培养软骨细胞,均匀混和藻酸钠后,行自体移植。8周后取实验关节进行大体观察、苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组织化学法染色观察及O’driscoll组织学评分。结果:纳入小型猪8只,除其中1例因手术切断伸直肌腱而使猪关节活动障碍,其余均未见手术后关节活动障碍,所有手术无术后感染,无关节内感染,无动物死亡。移植的软骨细胞在藻酸钠载体中生长良好,形成透明软骨。根据O’driscoll组织学评分标准,实验组32个猪关节缺损修复的组织学评分为(20.25±1.64)分,高于单纯材料对照组的(7.46±1.29)分及空白对照组的(6.00±2.09)分。免疫组织化学染色可见修复软骨以表达Ⅱ型胶原为主,无Ⅰ型胶原。结论:藻酸钠复合自体软骨细胞作为软骨移植的替代物是可行的,远期效果还有待进一步研究。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑血肿周围组织和海马bax及bcl-2基因表达的调节

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑出血后出血灶周围脑组织和出血侧海马bax、bcl-2基因表达的影响,探讨神经营养因子对神经细胞调亡的调控。方法:实验于2006-01/10在广西医科大学医学科学实验中心完成。①取成年清洁级Wistar大鼠72只,雌雄各半,体质量250g左右。②采用脑内囊注射胶原酶建立大鼠脑出血模型,动物于苏醒后按Bederson法进行神经病学评分,评分>3分后入选本实验,入选72只大鼠随机抽签法分为3组,每组24只。碱性成纤维细胞生长因子组按8μg/kg剂量肌肉注射,1次/d;生理盐水组肌肉注射等剂量的生理盐水,1次/d;模型组不作任何干预。③每组分别于干预后1,3,7d随机抽取8只大鼠,麻醉状态下取出血灶周围脑组织和出血侧海马,采用半定量反转录-聚合酶链反应检测调亡调控基因bax mRNA,bcl-2mRNA的表达。结果:在建立脑出血模型中共5只大鼠死亡,随后对死亡动物进行解剖,发现脑内血肿量过大,致脑疝形成而导致死亡,后随机补充动物。72只大鼠进入结果分析。①血肿周围脑组织bax mRNA表达:干预后3d,7d,碱性成纤维细胞生长因子组血肿周围脑组织bax mRNA表达比生理盐水组明显减少(3d:0.54±0.19,0.76±0.23,P<0.05;7d:0.45±0.19,0.71±0.16,P<0.01)。②血肿周围脑组织bcl-2mRNA表达:干预后3d,7d,碱性成纤维细胞生长因子组的血肿周围脑组织bcl-2mRNA表达比生理盐水组明显增高(3d:0.68±0.25,0.39±0.19,P<0.05;7d:0.80±0.21,0.48±0.18,P<0.01)。③出血侧海马bax mRNA表达:干预后3d和7d,碱性成纤维细胞生长因子组的出血侧海马bax mRNA表达比生理盐水组均明显减少(3d:0.54±0.18,0.70±0.11;7d:0.43±0.24,0.69±0.18,P均<0.05)。④出血侧海马bcl-2mRNA表达:干预后3d和7d,碱性成纤维细胞生长因子组的出血侧海马bcl-2mRNA表达比生理盐水组均明显增多(3d:0.66±0.11,0.50±0.15;7d:0.72±0.12,0.52±0.22,P均<0.05)。结论:碱性成纤维细胞生长因子能调节凋亡相关基因,提高大鼠脑出血后大脑脑组织和海马bcl-2mRNA的表达,降低bax mRNA的表达。     

转录因子T-bet与哮喘大鼠气道炎症及川芎嗪的干预效应

目的:转录因子T-bet在支气管哮喘的发病中起重要作用,川芎嗪治疗哮喘有效。实验拟观察川芎嗪对哮喘大鼠气道炎症的影响和转录因子T-bet的调控作用。方法:实验于2005-11/2006-06在南京医科大学完成。①实验材料及分组:72只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、川芎嗪小剂量组(20mg/kg)、川芎嗪中剂量组(40mg/kg)、川芎嗪大剂量组(80mg/kg)和地塞米松组,每组12只。实验用磷酸川芎嗪注射液为丽珠集团利民制药厂生产)。②实验过程及评估:以卵蛋白腹腔注射并雾化吸入制备大鼠哮喘模型,末次雾化后24h内麻醉后处死大鼠。观察6组大鼠肺组织形态学变化;测定支气管壁厚度、支气管平滑肌厚度、嗜酸粒细胞和淋巴细胞数。采用免疫组织化学半定量法测定肺组织T-bet蛋白的表达;进行转录因子T-bet蛋白表达量与气道炎症的相关性分析。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。结果:①哮喘模型组嗜酸粒细胞、淋巴细胞、支气管壁厚度和支气管平滑肌厚度,明显高于正常对照组相应指标(P均<0.01);与哮喘模型组比较,川芎嗪小、中、大剂量组和地塞米松组上述4项指标均减少(P均<0.01)。②哮喘模型组、川芎嗪小、中、大剂量组和地塞米松组的T-bet表达量低于正常对照组(P均<0.01);与哮喘模型组比较,川芎嗪小、中、大剂量组T-bet表达量增加(P均<0.01);随着川芎嗪剂量增加,T-bet表达量亦相应增加,川芎嗪小、中、大剂量组之间两两比较,差异均有统计学意义(P均<0.01)。③相关分析显示哮喘模型组T-bet蛋白表达量与嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润数呈负相关(r=-0.81,-0.85,P<0.01),与支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度呈负相关(r=-0.77,-0.79,P<0.01)。结论:支气管哮喘大鼠存在T-bet低表达;川芎嗪可抑制气道炎症,增加转录因子T-bet蛋白的表达,纠正Th1/Th2失衡,从而治疗支气管哮喘。     

北京市东城区289名健康中老年人骨密度测量

背景:研究表明,健康男女骨密度峰值出现在大约20～40岁之间,进入中老年后骨量逐渐下降,从而导致骨质疏松症.目的:分析北京市东城区2个居委会289名健康中老年人骨密度变化及骨质疏松患病特征.设计:横断面调查.单位:卫生部北京医院北京老年医学研究所.对象:于1998-06/09采用整群随机方法选择北京市东城区2个居委会的289名45岁以上健康居民, 男136名,女153名,年龄45～85岁.排除标准:①肝肾功能异常.②有影响骨代谢的各种因素(如:各种急慢性疾病;长期服用激素、钙剂等药物史;体脂指数小于19 kg/m2或大于28 kg/ m2;长期卧床3个月以上;特殊职业人群).所有受试对象均对检测项目知情同意.方法:采用美国Lunar公司的双能X线骨密度仪对所有受试对象进行骨密度测定,部位为左侧股骨近端(股骨颈,大转子,Ward's三角区),腰椎2～4前后位.按世界卫生组织提出的骨质疏松症的诊断标准及本攻关项目获得的骨峰值确定各个部位骨质疏松症的诊断标准,股骨径:男性0.665 g/cm2,女性0.677 g/cm2;大转子:男性0.598 g/cm2,女性0.506 g/cm2;Ward's三角区:男性0.492 g/cm2,女性0.514 g/cm2;腰椎2～4:男性0.760 g/cm2,女性0.835 g/cm2.同时参考"九五"攻关课题获得的骨峰值计算骨量丢失率和骨质疏松的患病率.主要观察指标:不同性别不同部位受试对象骨密度、骨量丢失率及骨质疏松患病率.结果:纳入调查对象289名均进入结果分析.①男性的骨密度随年龄增高的趋势不显著,女性骨密度降低以及骨量丢失均十分突出,且以55岁以后更加明显.②按部位分析骨量累积丢失率,男女均依次为Ward's三角区>股骨径>大粗隆>腰椎2～4.③骨质疏松患病率随年龄明显升高,女性显著高于男性,差异有统计学意义(P＜0.01).骨质疏松发生以股骨径最高,其次是Ward's三角区和腰椎2～4.结论:女性性别和年龄增加,尤其是绝经期是骨质疏松发生的危险因素,股骨径、Ward's三角区、以及女性腰椎2～4是易发骨质疏松部位.