rDNA-ITS2序列作为中国按蚊分子鉴别特征的评述：Ⅱ塞蚊亚属

为评价核糖体DNA第2内转录间隔区（ rDNA-ITS2）序列作为中国按蚊属塞蚊亚属蚊种鉴别的分子特征。笔者整理和分析了数据库中注册的所有中国记录的塞蚊亚属蚊种的rDNA-ITS2序列,并应用MEGA软件计算其在种内和种间的差异性（ p距离）。截止2013年7月, GenBank中已注册ITS2序列共442条,隶属塞蚊亚属蚊27种。计算结果显示, ITS2序列在大多数种内的变异性小于1％;而注册的浅色按蚊、乌头按蚊和溪流按蚊的序列种内差异较大,无法确定其种特异序列;忽略上述3蚊种进行计算的其他种间序列差异性范围为2.80％（大劣按蚊与大劣按蚊D）～68.3％（多斑按蚊与迷走按蚊）。结果提示rDNA-ITS2序列在中国塞蚊亚属大多数蚊种中具有良好的种内保守性和种间解析度,少数种类无法区分。     

嗜人按蚊rDNA—ITS2基因的克隆鉴定及SNP分析

目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA（rDNA）第2内转录间隔区（ITS2）序列，研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性（Single Nuclear Polymorphism，SNP）。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板，利用蚊虫5．8s和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因，扩增产物经回收纯化后连接到TA载体，经amp^＋LB固体平板筛选的阳性克隆。经amp^＋LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因。纯化后重组克隆经PCB鉴定可重现556bp的特异性条带，其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99．6％，其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入，在556的范围内有一个A→T，一个G→T的颠换；一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守，但不同个体间也存在一定的SNP多态性。     

嗜人按蚊rDNA-ITS2基因的克隆鉴定及SNP分析

目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA（rDNA）第2内转录间隔区（ITS2）序列，研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性（Single Nuclear Polymorphism，SNP）。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板，利用蚊虫5．8s和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因，扩增产物经回收纯化后连接到TA载体，经amp^＋LB固体平板筛选的阳性克隆。经amp^＋LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因。纯化后重组克隆经PCB鉴定可重现556bp的特异性条带，其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99．6％，其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入，在556的范围内有一个A→T，一个G→T的颠换；一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守，但不同个体间也存在一定的SNP多态性。     

基于核糖体 DNA 第二内转录间隔区基因的 9 种蚊虫分子鉴定

目的 分析常见 9 种蚊虫核糖体 DNA 第二内转录间隔区( rDNA-ITS2 )基因序列特征,为蚊虫种类分 子鉴定方法探讨提供依据。 方法 在山东省济宁市采集淡色库蚊、三带喙库蚊、二带喙库蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、中 华按蚊、骚扰阿蚊、常型曼蚊和黄色柯蚊成蚊,形态学种类鉴定后,提取上述 9 种蚊虫 DNA,PCR 扩增 rDNA-ITS2 基 因并测序;在 GenBank 中进行同源性比对,采用 Bioedit 7. 0 软件及 DNAMAN 软件对测序结果进行比对分析,通过 DNASTAR、ClustalX 1. 81 和 Mega6 软件分析列特征并构建系统进化树探讨系统发生关系。 结果 9 种蚊虫的 rDNA- ITS2 长度在 343 bp 与 577 bp 之间,共有 59 个保守位点、449 个变异位点、235 个简约信息位点和 191 个单态位点,9 种蚊虫种间序列同源性为 28. 21% ~ 53. 76%;所有蚊虫的 rDNA-ITS2 基因分子鉴定与形态学鉴定吻合率 100%,库 蚊属的淡色库蚊、三带喙库蚊和二带喙库蚊聚成一类,伊纹属的白纹伊蚊和刺扰伊蚊聚成一类,不同种蚊虫为独立 分支。 结论 核糖体 DNA 第二内转录间隔( rDNA-ITS2 )基因可用于蚊虫属和种的鉴定。     

应用PCR-SSCP分析我国不同地区常见嗜尸蝇类的研究（英文）

目的探讨应用PCR-SSCP分析我国不同地区常见嗜尸蝇类,揭示其亲源关系及基因差异。方法采集了中国部分城市,即广州、深圳、阳江、南京、长春、宜昌、北京、武汉、成都等地的常见嗜尸蝇类：家蝇（Musc domestica）,丝光绿蝇（Lucilia sericata）,大头金蝇（Chrysomya megacephala）,黑尾麻蝇（Helicophagella melanura）,棕尾麻蝇（Boettcherisca peregrina）等。用PCR-SSCP分析我国不同嗜尸蝇类的rDNA-ITS2基因片段。结果PCR-SSCP分析结果显示,Chrysomya megacephata,Aldrichina grahami（巨尾阿丽蝇）,Helicophagella melanura,Musc domestica,Boettcherisca peregrina rDNA-ITS2基因的单链DNA（ssDNA）迁移率均有明显差异,我国不同地区常见嗜尸蝇种类rDNA-ITS2基因单链DNA迁移图型呈现多态性。结论我国不同地区常见嗜尸蝇种类的rDNA-ITS2基因存在种内、种间及地理的基因多态性。     

库蠓核糖体DNA内转录间隔区1序列的测定与分析

目的 测定核糖体DNA内转录间隔区1(nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1, rDNA-ITS1)序列进行库蠓种类鉴别与系统发育分析,以探究rDNA-ITS1序列在库蠓分子鉴定和系统发育研究方面的适用性。方法 采用DNA扩增、纯化、克隆及测序的方法获得荒川库蠓Culicoides arakawai、凹缘库蠓C. holcus、连斑库蠓C. jacobsoni、印度库蠓C. indianus、霍飞库蠓C. huffi和肩宏库蠓C. humeralis等6种库蠓的rDNA-ITS1序列,基于Kimura 2-parameter公式计算种内和种间遗传距离,应用MEGA 6.06软件分析DNA序列碱基组成并以环纹埃蠓Allohelea annulata为外群构建系统发育树(邻接法和最大似然法)。结果 上述6种库蠓的rDNA-ITS1序列经过Clustal W比对及人工校对和编辑后的长度为352 bp,其中T、C、A、G 4种碱基的含量分别为36.8%、13.0%、30.0%和20.1%,A+T的含量(66.8%)高于C+G的含量(33.1%);K-2p遗传距离在种内和种间具显著差异(t=32.430,P<0.05);系统发育树中不同种类库蠓各自构成单系(群),同种类不同地理种群聚为一支,其与形态学鉴定结果一致。结论 本研究证实了rDNA-ITS1序列可用于进行库蠓及其近似种的分子鉴定和系统发育分析。     

云贵两省三地牛带绦虫核糖体rDNA-ITS1序列分析

目的: 采用PCR克隆测序方法,对采自贵州省都匀、从江及云南省大理三地牛带绦虫,与台湾桃园牛带绦虫亚洲亚种标本进行比较,为贵州都匀、从江及云南大理牛带绦虫标本鉴别提供分子生物学证据,并进一步探讨牛带绦虫亚洲亚种分类学地位.方法: 取贵州都匀株、贵州从江株、云南大理株和台湾桃园株成虫节片,抽提DNA,PCR扩增rDNA-ITS1区段,克隆测序;结合GenBank中已知猪带绦虫rDNA-ITS1序列,构建系统发育树.结果: 贵州都匀、云南大理牛带绦虫标本、台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的ITS1序列基本一致,同源性达98%～99%;贵州从江牛带绦虫标本ITS1序列与前三者有30个碱基差异,与台湾桃园、贵州都匀和云南大理同源性均为97%.系统发育树显示:贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本与台湾牛带绦虫亚洲亚种标本的遗传距离最接近,距贵州从江牛带绦虫标本较远,与猪带绦虫则更远.结论: (1)贵州都匀和云南大理牛带绦虫标本属于牛带绦虫亚洲亚种,贵州从江牛带绦虫标本属于传统牛带绦虫.(2)rDNA-ITS1序列分析可以用于牛带绦虫亚洲亚种与传统带绦虫分类学研究.     

中国耶氏肺孢子虫基因型的初步分析

为研究我国耶氏肺孢子虫的基因分型,利用巢式PCR方法扩增24例肺孢子虫肺炎(PCP)患者支气管肺泡灌洗液中的耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)核糖体DNA内转录间隔区(ITS1-5.8S rDNA-ITS2)基因。纯化回收目的片段,将其克隆到PMD18-T载体,并导入JM109细胞系中,每个标本制备3~5个克隆,提取质粒测序。从19例患者的标本中检出ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因,其中12份标本的25个克隆的测序结果可用于基因分型。经与Lee等(1998)的分型标准进行比对,本组病例耶氏肺孢子虫的ITS1分为B、E、I、N4型,最常见的为E型;ITS2分为a、b、e、h、i、n6型,最常见的为i型;ITS基因分9型,以Bi多见,有2份标本存在混合感染。     

蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的分子系统学研究

以5月和6月两个不同时段采集的分别产于青海省化隆县和四川省康定县的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)新鲜子实体为材料，采用分子生物学方法，以rDNA-ITS序列为分子标记，对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)与冬虫夏草之间的关系进行了探讨。以真菌通用引物ITS1/ITS4分别对蝙蝠蛾拟青霉及冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA进行PCR扩增，获得的片段克隆到pMD18-T Vector上进行测序，结果表明，随机挑取的46个克隆与某些已在GenBank中注册的中国被毛孢(Hirsutella sinensis) 或冬虫夏草的rDNA-ITS序列的一致性均在99%以上，但与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列的一致性约为72%。根据蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列设计了两对特异引物，分别以不同产地及不同生长时期共4个批次的冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA为模板，进行PCR及巢式PCR扩增，均得到了相应片段，该片段与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列具有100%的一致性。在GenBank中注册号为AB067740的另一个标明为冬虫夏草的rDNA-ITS序列与注册号为AJ309353的中国被毛孢的rDNA-ITS序列一致性仅为87.3%，但根据AB067740序列设计特异引物，也从冬虫夏草基因组DNA中扩增到其相应序列。研究结果表明，在天然冬虫夏草中除了中国被毛孢之外，还普遍存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌。     

我国辽宁省赫坎按蚊种团的分子鉴别研究

为更新和补充辽宁省按蚊多样性的本底资料,笔者对2008年在辽宁省5个地点采集的按蚊进行形态和PCR分子鉴别,并随机抽取已鉴别的和未获鉴别的样本,进行rDNA-ITS2序列测定和分析.本研究共鉴别了168个个体,均为赫坎按蚊种团成员种,分别是中华按蚊(n=14)、雷氏按蚊(n=4)、八代按蚊(n=113)、比伦按蚊(n=2)和克莱按蚊(n=35).