气相色谱法测定药物中间体2-甲基咪唑中乙醛的残留量

目的:建立药物中间体2-甲基咪唑中乙醛残留量的测定方法。方法:采用气相色谱法,液体进样,以Agilent DB-624（75 m × 530 μm × 3 μm）为分析柱,FID检测器;恒温:50 ℃,保持5.5 min;N2流量为6 mL·min-1;后运行:温度为240 ℃,保持10.5 min, 流量为8 mL·min-1。采用外标法。结果:液体进样可以避免高温条件下的基质效应对乙醛测定的影响,乙醛在1.36~ 188.96 μm·mL-1内线性关系良好,R2=0.999 9,方法的回收率在99.74％~102.87％且RSD（n=9）=1.19％,最低检出限为0.55 μm·mL-1。结论:气相液体进样法操作简单、专属性强、重现性强、灵敏度高,可以用于乙醛残留量的检测。     

可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定

目的 合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法 利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链（β2m），在人工合成的HLA-G1限制性九肽（KGPPAALTL）存在的条件下，通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体（W6／32及兔抗人β2m抗体）进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验，检测稀释复性的折叠产物。结果 折叠复合物含有35％可溶性HLA-G1-肽复合物、5％可溶性HLA-G1重链聚合体及60％复性的β2m3种成分。结论 通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。     

加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。     

HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的 构建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达.方法 采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoR Ⅰ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体.分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFast BacTMDual+[DR1/Fc].对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Western blot检测HLA-DR1的表达.结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA和Western blot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象.结论 成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础.     

可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化

目的 探讨可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化.方法 原核高效表达的HLA-G重链及轻链(β2m)在抗原肽(人工合成九肽NH2-KGPPAALTL-COOH)的存在下,通过稀释复性折叠成HLA-G-肽复合物,采用凝胶过滤层析对折叠复合物进行纯化.利用特异性抗体(mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)进行ELISA和Western blot对纯化产物进行鉴定.结果 折叠复合物中,主要含有HLA-G重链聚合体、HLA-G-肽复合物及β2m 3种成分,纯化后主要为HLA-G-肽复合物.结论 成功地获得纯度较高的可溶性HLA-G-肽复合物单体,为进一步研究HLA-G的生物学功能奠定了基础.     

可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化

目的 研究可溶性HLA—A＊2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法 将原核高效表达的可溶性HLA—A＊2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白（β2m）与HLA—A＊2402限制性抗原肽Epstein—Barr病毒（EBV）即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠，形成HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体，并在BirA酶的作用下进行生物素化，使生物素结合到HLA—A＊2402-pBRLF1复合物中H链c端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗（W6／32和兔抗人β2m抗体）及链霉亲合素进行ELISA和Western blot，检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞（aAPCs）诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）。结果折叠复合物中，主要含有HLA-A＊2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分，其中HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体。结论HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体构建成功。为特异性CTL的检测提供了有力的工具。     

同种CTL识别表位的抗原肽非依赖性现象

目的 初步探讨细胞毒T细胞(CTL)对同种抗原的识别机制.方法 用负载特定肽的T2细胞与HLA-A2阴性个体的外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)共培养,激活同种反应性CTL,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法观察同种反应性CTL对不同载肽T2细胞的杀伤活性.结果 用负载特定抗原肽的T2细胞诱导所获得的同种反应性CTL对负载不同抗原肽的T2细胞及空载T2细胞具有同等杀伤效应.结论 同种反应性CTL对同种MHC分子的识别不依赖抗原肽.     

同种T细胞前体频率与MHC-抗原肽种类呈正相关

目的用种类数目不同的肽段加载T2（表达空载HLA-A2分子）细胞与HLA-A2阴性个体的PBL混合培养，探讨同种反应性CIL前体的频率与同种抗原表位种类多少的关系。方法通过人工合成HLA-A2限制性单一病毒抗原肽、10种细胞正常成分的肽段以及冻融酸处理法制备细胞混合肽。加载T2细胞，经丝裂霉素灭活后作为刺激细胞，与PKH67预染HLA-A2阴性个体PBL进行混合淋巴细胞培养，PKH67荧光强度随细胞增殖而递减，通过流式细胞仪增殖软件（ModFit）分析同种T细胞前体频率。结果单独PBL增殖不明显；空载T2细胞刺激同种反应性CTL前体的频率为0．052819；加载单一表位肽的T2细胞刺激时，前体的频率为0．030429；10种HLA-A2自身限制性的混合抗原肽负载时，前体的频率为0．144942；混合多肽负载时，前体的频率为0．203649。结论本研究结果显示了同种T细胞前体的频率随着同种抗原表位种类的增多而增高，与同种抗原的密度不相关；支持了强烈的同种反应的主要原因是同种细胞表面表达极其繁多的T细胞识别表位（即pMHC）。     

生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的 制备生物素化的HLA-A＊2402-抗原肽复合物。方法 将原核高效表达的sHLA-A＊2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A＊2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠，形成HLA—A＊2402-抗原肽复合物单体，并在BirA酶作用下进行生物素化，使生物素结合到HLA-A＊2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA—A＊2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体（W6／32和兔抗人β2微球蛋白抗体）及链霉亲合素进行ELISA和Westem blot，检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 折叠复合物中，主要含有HLA—A＊2402-肽复合物单体及β2两种成分，其中HLA-A＊2402-肽复合物单体可生物素化。结论 成功制备出生物素化的HLA—A＊2402-抗原肽复合物单体，为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。     

人MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白的构建、表达及功能检测

目的 构建MR1/IgG1 Fc融合蛋白杆状病毒表达载体并使其在昆虫细胞内表达获得MR1/IgG1 Fc二聚体,制备人工抗原提呈细胞用于黏膜相关恒定T细胞(MAIT)反应性代谢物及MAIT细胞功能调控研究。方法 从人外周血单个核细胞中扩增β2m编码基因。商业化合成MR1胞外段和IgG1 Fc融合基因的全序列基因MR1/IgG1 Fc,与β2m基因重组构建pFastBac^TM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]表达载体;利用Bac-to-Bac昆虫表达系统表达MR1/IgG1 Fc二聚体融合蛋白,并通过双抗体夹心ELISA、Western blot及流式细胞术进行检测。建立MR1/IgG1 Fc二聚体加载的人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cells, aAPCs),即MR1 aAPCs,提呈大肠埃希菌(DH5α)来源的代谢物,与人外周血单个核细胞共培养,检测MAIT细胞的活化和增殖水平。结果 经PCR及测序鉴定证实pFastBac^TM Dual+[β2m+MR1/IgG1 Fc]载体中MR...