鳖甲防治肝纤维化实验研究

目的：观察鳖甲不同剂型防治大鼠肝纤维化效果并探讨其作用机制。方法：用四氯化碳（CCl4）诱导形成大鼠肝纤维化模型，采用鳖甲不同剂型进行预防和治疗，并与正常对照组、模型对照组相比较，观察各组大鼠病理组织学、肝组织胶原含量、免疫组化细胞因子的表达、血清透明质酸、肝功能、肝组织氧化指标，透射电镜观察肝组织超微结构的改变等。结果：鳖甲煎煮液组SSS计分、肝组织胶原含量、纤雏化指标、促肝纤维化因子、血清酶学指标显著低于模型组与鳖甲微粉组，而抗氧化指标显著上升（P〈0．05-0．01）。结论：鳖甲煎煮液能有效地预防和治疗大鼠肝纤雏化，效果显著，其作用机制可能是通过抗脂质过氧化、改善肝组织病理、改善肝功能、调控细胞因子水平等而发挥抑制肝星状细胞（HSC）活化增殖及细胞外基质（ECM）合成分泌、促进ECM降解吸收等综合作用，阻断和治疗肝纤维化。鳖甲微粉药液无此作用。     

细胞周期素D1和p27kip1在肾癌中的表达及其意义

目的:探讨cyclin D1、p27kip1在普通型肾细胞癌(conventional renal cell carcinoma,CRCC)发生、发展中的作用。方法:用定量RT-PCR和Western-blot方法检测25例CRCC组织和10例肿瘤远端的正常肾皮质中cyclin D1和p27kip1的mRNA和蛋白的含量;用免疫组化方法检测76例CRCC中cyclin D1、p27kip1的表达;分析cyclin D1、p27kip1的表达与肿瘤分期、分级及术后生存率的相关性。结果:CRCC中cyclin D1的mRNA和蛋白含量分别为0.488±0.399和1.069±0.371,高于正常对照组0.089±0.066和0.281±0.253(P均<0.01);cyclin D1的表达与肿瘤体积大小有关,体积大者cyclin D1高表达(P<0.05);CRCC中p27kip1mRNA和蛋白含量分别为0.191±0.111和0.146±0.051,低于正常对照组0.374±0.216和1.004±0.318(P均<0.01),随着p27kip1表达的降低,肿瘤的细胞核Fuhrman分级、TNM分期增高;p27kip1阳性组患者的5年生存率为84.26%,高于p27kip1阴性组25.25%(P<0.01)。结论:cyclin D1高表达和p27kip1的低表达与CRCC的发生有关;p27kip1的低表达可能促进肿瘤的演进,检测p27kip1可作为评价CRCC预后的参考指标。     

核心蛋白聚糖Ⅱ过表达对肾组织细胞基质金属蛋白酶2和9表达的影响

目的 观察高水平表达的核心蛋白聚糖Ⅱ(DCN)对高糖培养的大鼠肾组织细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响.方法 用大鼠DCN重组腺病毒载体(Ad/DCN)和抗转化生长因子(TGF)-β1中和抗体分别处理不同糖浓度培养条件下的大鼠肾系膜细胞(RMC)和肾小管细胞(HK-2),用Western印迹法观察转染72 h后DCN蛋白水平变化及其对TGF-β1和Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)以及MMP-2和MMP-9表达水平的影响.结果 在RMC细胞中,TGF-β1和C-Ⅳ的蛋内表达在高糖条件下升高(分别为1.63±0.02和0.52±0.01),经抗TGF-β1中和抗体或用Ad/DCN转染处理72 h有明显下降(TGF-β1均下降至0,C-Ⅳ分别为0.29±0.01和0.21±0.01,均P＜0.05);MMP-2和MMP-9在高糖条件下表达下降(分别为0.01±0.00和0.32±0.01),经抗TGF-β1中和抗体或用Ad/DCN转染处理72h有明显上升(MMP-2分别上升至0.65±0.01和0.67±0.01,MMP-9分别上升至0.89±0.01和0.73±0.01,均P＜0.05).而在HK-2细胞中,TGF-β1和C-Ⅳ的蛋白表达在高糖条件下也升高(分别为1.45±0.0l和0.41±0.01),且MMP-2的表达升高(0.27±0.01),经抗TGF-β1中和抗体或用Ad/DCN转染处理72h则有明显下降(TGF-β1分别为0.06±0.01和0.08±0.01,C-Ⅳ分别为0.11±0.01和0.01±0.00,MMP-2分别为0.14±0.01和0.06±0.01,均P＜0.05).结论 高糖对肾小球系膜细胞和小管细胞的基质金属蛋白酶表达的影响是不同的,降低TGF-β1活性可使肾小球系膜细胞和小管细胞基质金属蛋白酶表达转变.     

HBx-siRNA快速筛选体系的建立和应用

目的:建立针对HBx的小干扰RNA(siRNA)快速筛选体系.方法:①构建HBx与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)N端融合表达质粒;②用一步PCR法,制备针对HBx mRNA的RNA多聚酶启动子-siRNA表达框(SEC);③将SEC转染HBx-EGFP瞬时表达的AD293细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察分析SEC对HBx-EGFP荧光表达的抑制效果,从而确定有效siRNA.结果:①成功构建HBx-EGFP融合表达质粒pHBx-EGFP,在瞬时表达细胞中,HBx-EGFP绿色荧光主要呈颗粒状,聚集在核膜与核膜外周或细胞浆;②共转染SEC能有效抑制HBx-EGFP的瞬时表达.与siHBx271相比,siHBx388是一高效siRNA位点,并且该位点与tRNAVal和H1启动子搭配更有效.结论:成功建立表达HBx的荧光蛋白报告体系,结合快速制备SEC的方法,可用于进行HBx有效siRNA及其最适搭配启动子的快速筛选.     

类风湿关节炎患者RANTES及MCP-1的测定及其意义

目的 研究类风湿关节炎（RA）患者血清、关节滑液中调节活化正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）及单桂细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达水平，探讨其在RA致病中的作用。方法 用酶联免疫吸附法（ELISA）测定27例类风温关节炎患者血清及病变膝关节滑液中RANTES、MCP-1水平，井与外伤截肢者对照。结果 RA患者血清及滑液中RANTES、MCP-1水平明显高于时照组，且RA滑液中RANTES水平高于血清。结论 以上研究结果提示RA病变关节组织是RANTES产生的主要部位。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转染对T细胞活化和亚群分布的影响

为了隆低造血干细胞移植患者移植物抗宿主病（GVHD）的发生，人们试图在输注的淋巴细胞中转染一种自杀基因，这种外源基因使输注的T细胞对特殊药物具有敏感性，设置了一种特定“开关”。当严重的CVHD发生时，应用特定药物特异性杀伤T细胞，达到防治GVHD的目的。为此我们构建了含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-ik）的pBabe-puro逆转录病毒载体。     

咪唑斯汀对致敏小鼠脾淋巴细胞释放LTB_4和IL-5的抑制作用

目的　观察咪唑斯汀对卵蛋白(OVA)致敏的小鼠脾淋巴细胞释放白三烯B4 (LTB4)和白介素5 (IL 5)的影响。方法　实验第1天及第15天给小鼠腹腔注射OVA,构建致敏动物模型,分离实验小鼠脾淋巴细胞进行培养,以不同浓度咪唑斯汀及对照药物预处理,加入OVA再次刺激,采用竞争酶联免疫吸附法(CompetitiveELISA)检测培养细胞上清液中LTB4及IL 5水平。结果　致敏组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中LTB4和IL 5水平分别为1 1 1. 0 6±1 5. 9 8pg/ml和333. 54±24. 76pg/ml,较正常组小鼠显著升高(P<0. 01)。1. 0μmol/L和10μmol/L的咪唑斯汀可显著抑制致敏小鼠脾淋巴细胞产生LTB4和IL 5。对照药物为1. 0μmol/L的地塞米松,对LTB4和IL 5的释放均具显著抑制效应;而10μmol/L的扑尔敏及氯雷他定对LTB4和IL 5的抑制不明显。结论　咪唑斯汀对致敏小鼠脾淋巴细胞LTB4和IL 5的释放具有剂量依赖性的抑制作用。     

ESAT-6/CFP-10融合蛋白的抗原性分析及其对诊断结核临床应用价值

目的 分析ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为结核抗原的特性,并探讨以其作为抗原的酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在结核诊断中的应用价值.方法 以ESAT-6/CFP- 10融合蛋白为刺激抗原的EIISPOT法(ESAT-6/CFP-10-ELISPOT)检测经结核特异性抗原刺激后分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞数量方法,测定65例单纯结核病患者,16例HIV/结核双重感染患者,20例HIV感染患者,32例非结核呼吸道疾病患者,30名健康体检者外周血单个核细胞中结核菌抗原特异的T淋巴细胞的频率.结果 ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT与结核菌素皮肤试验(TST)在所有81例结核患者中的比较,ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT阳性率98.8％,TST阳性率为56.8％;ESAT-6/CFP-10-ELISPOT在涂阳结核组、涂阴结核组、HIV/结核双重感染组阳性率分别为100.0％、97.1％、100.0％,其敏感性远高于痰涂片检查,且各组结果差异无统计学意义;20例HIV感染组有1例阳性,非结核呼吸道疾病患者组与健康对照组均为阴性,提示ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT方法的特异度为98.8％.结论 ESAT-6/CFP-10融合蛋白可以很好的刺激效应T淋巴细胞分泌γ干扰素,适合作为结核诊断中的特异性抗原,因而可以用于ELISPOT的检测,ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT对结核诊断有应用价值.     

耐氟喹诺酮类肺炎克雷伯菌GyrA和ParC的变异

目的 研究肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位（GyrA0和拓扑异构酶ⅣC亚基（ParC)的变异与其耐氟喹诺酮类（FQNL）的关系。方法 采用琼脂平板双倍稀释法测定环丙沙星，左氧氟沙星，依诺沙星和诺氟沙星对临床分离的31株肺炎克雷伯菌及其标准菌株ATCC10031的最低抑菌浓度并对此32株菌GyrA的基因（gyrA)和ParC的基因（parC)进行PCR扩增和DNA序列的分析比较。结果 19株耐FQNL菌都存在GyrA变异同FQNL耐药性相关的变异有Ser83(TCC)→Phe(TTC0,Ile(ATC),Tyr(TAC)和Lys(TGC);Asp87(GAC)→Ala(GCC)，其中Ser83(TCC)→Phe(TTC0,Ile(ATC),Tyr(TAC)和Lys(TGC);Asp87(GAC)→Ala(GCC)。其中Ser83→Ile,Lys的变异是新发现，在9株高度耐FQNL和1株低度耐FQNL菌中同时存在ParC的变异，同FQNL耐药性相关的变异有丝氨酸Ser80(AGC)→Ile(ATC),ATCC10031的ParC同大肠埃希菌的ParC具有很好的同源性。结论 在耐FQNL肺炎克雷伯菌中普遍存在着GyrA的变异其中以Ser83的变异多见，当细菌有GyrA的变异，同时合并有ParC的变异时，其耐药性往往会增强。     

血管紧张素II和缬沙坦对人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体表达的影响

目的　研究血管紧张素II(AngII)和AngIII型受体 (AT1)拮抗剂缬沙坦对人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)血凝素样氧化低密度脂蛋白受体 (LOX 1)基因转录和蛋白表达的影响 ,以进一步探讨AngII和LOX 1在动脉粥样硬化 (AS)中的地位和相互关系 ,以及缬沙坦可能的抗AS作用。方法　将不同浓度AngII(1× 10 -5～ 1× 10 -10 mol/L)与HUVECs共孵育 2 4h ,以及将 1× 10 -6mol/L浓度的AngII与HUVECs作用不同时间 (0、3、6、12、2 4、36、4 8h)后 ,用细胞酶联免疫法和半定量RT PCR分别检测LOX 1蛋白和mRNA表达的情况 ,并观察缬沙坦对此的影响。结果　AngII呈浓度依赖方式诱导HUVECsLOX 1蛋白和mRNA表达增加 ;10 -6mol/L的AngII作用 3h ,内皮细胞LOX 1蛋白和mRNA表达即有显著增高 (P <0 0 0 1) ;随着时间延长 ,LOX 1蛋白和mRNA表达量逐渐增加 ,至 2 4～ 36h达最高峰。缬沙坦可显著抑制AngII诱导的HUVECsLOX 1表达 ,使LOX 1表达接近于正常水平。结论AngII能明显增强HUVECs表达LOX 1,并呈浓度和时间依赖性 ,这可能是AngII促进动脉粥样硬化发生、发展的机制之一 ;此作用可被AT1拮抗剂缬沙坦阻断 ,从而产生可能的抗AS作用。