左归丸和巴氯芬联用对脑瘫鼠运动认知的影响

目的：探讨左归丸和巴氯芬联用对新生脑瘫大鼠运动协调能力和认知能力的影响，并研究其可能的机制。方法随机将SD大鼠分为假手术组、脑瘫（ CP）模型未给药组、CP模型左归丸组、CP模型巴氯芬组以及CP模型左归丸＋巴氯芬联用组。分别于药物处理前，处理7、14、21、28天及治疗结束后7天时分别测定各组大鼠神经行为学指标，治疗结束后7天后测定血清中肿瘤坏死因子（ TNF－α），一氧化氮合酶（ NOS）和脑组织中丙二醛（ MDA）、超氧化物歧化酶（ SOD）的变化。结果巴氯芬治疗组和联用组在服药14天后与同期CP模型未给药组比较肌张力显著降低（t值分别为4．603、5．590，均P＜0．05），通过平衡木时间缩短（t值分别为6．337、5．575，均P＜0．05）；而左归丸组于治疗28天后，大鼠通过平衡木时间才显著缩短（t＝6．124，P＜0．05）。左归丸治疗组和联用组大鼠服药28天后学习记忆能力较CP模型未给药组明显改善（ t值分别为－4．314、－5．314，均P＜0．05）；联用组效果优于左归丸组（t＝－2346，P＜0．05）；而巴氯芬处理组大鼠则无明显变化（t＝－2．025，P＞0．05）。与CP模型未给药组相比，左归丸组以及联用组大鼠的TNF－α、NOS和MDA显著降低，SOD显著升高，同时神经生长因子（ NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF） mRNA和蛋白水平升高（左归丸组：t 值分别为2．456、4．898、5．803、－6．144，－4．224、－5．124、－3．272、－4．166；联用组：t值分别为2．833、5．009、9．078、－6．056，－7．439、－7．142、－5．812、－4．301；均P＜0．05），联用组的作用比左归丸组更强（t值分别为2．613、3．241、2．624、－3．194、－3．275、－4．002、－3．986、－2．881，均P＜0．05），而巴氯芬组上述指标无明显变化（P＞0．05）。结论左归丸和巴氯芬联用与单独用药相比能明显改善大鼠运动，且有可能通过保护神经细胞，促进神经元的修复来改善其认知功能。     

龟鹿补骨方辨治绝经后骨质疏松症患者Th17/ Treg细胞因子的调节作用

目的:观察龟鹿补骨方辨治绝经后骨质疏松症(PMO)肝肾阴虚证的临床疗效,及对Th17/Treg细胞因子的影响。方法:将140例患者按随机数字表法分为对照组和观察组各70例。两组均给予西医治疗。对照组口服金天格胶囊,3粒/次,3次/d;观察组采用龟鹿补骨方辨证治疗,1剂/d;连续治疗6个月,并随访6个月。治疗前、治疗6个月和随访6个月采用双能X射线吸收检测法(DXA)测量腰椎L2-4骨密度和采用定量CT(QCT)测量腰椎骨密度;治疗前、治疗3个月和6个月进行肝肾阴虚证和中国人骨质疏松症生存质量简明量表(COQOL)评分;检测治疗前后雌二醇(E_2),Ⅰ型原胶原氨基端前肽(PINP),骨保护素(OPG),Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)水平;检测治疗前后CD4~+细胞,计算Th17细胞和Treg细胞;检测治疗前后白细胞介素-17(IL-17),IL-22,IL-10和转化生长因子-β_1(TGF-β_1)水平;进行安全性评价。结果:治疗6个月和随访6个月,两组DXA测量结果(腰椎L_(2-4)骨密度和T-值)和QCT骨密度均持续升高(P0.01),且观察组腰椎L_(2-4)骨密度,T-值和QCT骨密度均高于同期对照组(P0.01);治疗3和6个月,观察组肝肾阴虚证积分和生活质量评分均低于同期对照组(P0.01);观察组PINP,S-CTX和TRACP均低于对照组(P0.01),OPG,E_2水平均高于对照组(P0.01);观察组Th17细胞和Th17/Treg均低于对照组,Treg细胞高于对照组(P0.01);观察组IL-17,IL-22水平均低于对照组(P0.01),IL-10和TGF-β_1水平均高于对照组(P0.01)。未发现龟鹿补骨方相关不良反应。结论:在补充钙剂、维生素D等治疗基础上,龟鹿补骨方治疗PMO肝肾阴虚证患者,能进一步提高骨密度,升高雌激素水平,调节骨代谢标志物,Th17,Treg及相关因子的表达,逆转Th17/Treg失衡状况,减轻了临床症状,提高了生活质量,临床疗效优于金天格胶囊,且安全。     

左归丸促进骨髓形成肝细胞的分子机制研究

目的：探讨左归丸促进骨髓形成肝细胞的分子机制。方法：采用交叉性别骨髓移植模型，雌性BALB／c小鼠接受9．0Gys ^60Co源γ射线照射后，经尾静脉注射输入同种系雄性小鼠骨髓细胞，分左归丸组和模型组，6个月后处死实验动物，取肝组织标本。选用小鼠基因表达谱寡核苷酸芯片，观察实验小鼠肝组织基因表达谱的变化。结果：左归丸组小鼠在骨髓移植6个月后肝组织的基因表达谱与模型组比较有显著不同，差异表达基因有1147条，已知功能基因有533条，其中上调基因264条，下调基因269条。结论：左归丸可能是通过影响肝组织基因表达谱的变化促进骨髓形成肝细胞。     

左归丸和右归丸对自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响

目的通过观察左归丸与右归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型大鼠脑、脊髓组织淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响,探讨滋阴补肾法与温阳补肾法治疗EAE作用机制。方法应用髓鞘碱性蛋白与完全福氏佐剂,按体积比1：1制成抗原并于Lewis大鼠双后足垫下注射,建立EAE模型。120只Lewis大鼠随机分为正常组、模型组、激素组、左归丸组及右归丸组,每组24只,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,3mL／（只·d）;激素组免疫后给予生理盐水灌胃,3mL／（只·d）,发病后改为醋酸泼尼松混悬液灌胃,5mg／（kg·d）;左归丸组免疫后给予左归丸混悬液,2g／（kg·d）;右归丸组免疫后给予右归丸混悬液,3g／（kg·d）。直至处死。分别于急性期（免疫后15d）和缓解期（免疫后27d）随机选取各组大鼠,取脑和脊髓组织切片进行CD4^＋、CD8^＋、CD3^＋、CD19^＋免疫组化染色。结果造模后第15日及第27日,模型组脑和脊髓组织中CD4^＋免疫组化表达均较正常组升高（P〈0．01）,CD8^＋表达降低（P〈0．05）,CD4^＋／CD8^＋比值升高（P〈0．01）;同模型组比较,左归丸组、右归丸组、激素组CD4^＋免疫组化表达均降低（P〈0．01）,且在造模后第27日,左归丸组和右归丸组脊髓组织CD4^＋表达较激素组显著降低（P〈0．01）;造模后第15日,右归丸组和激素组CD8^＋表达较模型组升高（P〈0．01）,造模后第27日,左归丸组和激素组CD8^＋表达较模型组升高（P〈0．01）;不同时点激素组、左归丸组及右归丸组CD4^＋／CD8^＋比值均显著低于模型组（P〈0．05）;造模后第15日及第27日,模型组中枢神经系统CD19^＋免疫组化表达均较正常组升高（P〈0．01）,急性期左归丸组、右归丸组、激素组脊髓组织CD19^＋表达较模型组降低（P〈0．01）,缓解期则见左归丸组和右归丸组CD19^＋表达减少（P〈0．01）。结论EAE大鼠CD4^＋／CO8^＋比值升高,这在EAE发病中发挥重要作用。滋阴补肾法和温阳补肾法可下调CD4^＋表达,下调CD4^＋／CD8^＋比值来治疗EAE。     

左归丸对去势大鼠钙转运通路相关蛋白的影响

目的:探讨左归丸对去势大鼠骨密度和骨组织中钙转运通路相关蛋白的影响。方法:选取48只雌性SD大鼠,随机分为正常组,假手术组,模型组,尼尔雌醇组(0.167 mg·kg^-1),左归丸低、高剂量组(9.6,38.4 g·kg^-1)。除假手术组和正常组,其余组切除大鼠卵巢,造模成功后3个月进行各组干预。3个月后处死大鼠,检测大鼠骨密度(BMD)和骨代谢标志物;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测钙转运通路(骨组织)瞬时受体电位通道V5(TRPV5),钙结合蛋白-D28K(CaBP-D28K),钠钙交换器1(NCX1)和细胞膜钙汞(PMCA1b)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组血钙降低(P<0.01),与模型组比较,左归丸高剂量组和尼尔雌醇组大鼠血钙显著升高(P<0.01);与正常组比较,模型组BMD显著降低(P<0.01),与模型组比较,左归丸高剂量组与尼尔雌醇组大鼠BMD均有改善(P<0.05);与假手术组和正常组比较,模型组各蛋白表达均有不同程度上调(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,左归丸高剂量组中TRPV5蛋白表达有显著下调(P<0.01),各干预组中的CaBP-D28K与NCX1蛋白表达均有不同程度的下调(P<0.05,P<0.01),PMCA1b蛋白表达在左归丸低剂量组和尼尔雌醇组内表达均有不同程度下调(P<0.05,P<0.01)。结论:左归丸可不同程度的降低大鼠破骨细胞中TRPV5,CAPB-D28K,PMCA1b,NCX1等介导破骨细胞吸收钙离子的重要通道蛋白的表达,左归丸的抗骨质疏松机理有可能是通过抑制TRPV5介导的破骨细胞的骨吸收而起作用。     

从肾论治绝经后膝骨关节炎肝肾亏虚证的临床观察

目的:评价从肾论治的左归丸加减治疗绝经后膝骨关节炎(KOA)肝肾亏虚证的临床疗效及对内分泌激素和软骨代谢的影响。方法:将140例KOA患者根据随机按数字表法分为对照组和观察组各70例。两组患者均口服予盐酸氨基葡萄糖胶囊,1粒/次,2次/d,疗程共12周,疼痛明显加用塞来昔布胶囊,0. 2 g/次,1次/d,共4周。对照组口服抗骨增生丸,3 g/次,3次/d。观察组加服左归丸加减,1剂/d,两组疗程均为连续治疗12周。采用疼痛视觉模拟(VAS)评分评价治疗前后活动时和静息时疼痛程度;进行治疗前后西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数可视化量表(WOMAC)评分、膝关节骨性关节炎严重性指数(ISOA),肝肾亏虚证、焦虑自评量表(SAS)和抑郁自评量表(SDS)评分;检测治疗前后血清雌二醇(E2),促卵泡生成素(FSH),促黄体生成素(LH),转化生长因子-β(TGF-β),白细胞介素-1β(IL-1β),基质金属蛋白酶-3(MMP-3),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果:治疗后观察组患者活动时VAS和静息时VAS均低于对照组(P0. 01);观察组WOMAC总分及疼痛、僵硬、关节功能3个因子评分均低于对照组(P0. 01);观察组患者肝肾亏虚证,SAS和SDS评分均低于对照组(P0. 01);观察组ISOA总分和症状体征、最大步行距离、日常生活3个维度评分均低于对照组(P0. 01);观察组E2水平高于对照组,FSH,LH水平均低于对照组(P0. 01);观察组患者TGF-β水平高于对照组,TNF-α,IL-1β和MMP-3水平均低于对照组(P0. 01);观察组临床总有效率分别为89. 23%(58/65),高于对照组的74. 60%(47/63)(χ2=4. 793,P0. 05)。结论:采用左归丸加减内服从肾论治绝经后KOA肝肾亏虚证患者可明显减轻症状,改善关节功能,调节内分泌激素水平,减轻焦虑、抑郁,并可调节软骨代谢的环境,抑制炎症反应,提高了患者日常生活能力和临床疗效。     

左归丸对去势骨质疏松模型大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:观察左归丸对去势骨质疏松大鼠模型骨代谢和Wnt/β-链蛋白(β-catenin)信号通路的影响,探讨左归丸防治骨质疏松症的分子生物学机制。方法:采用双侧卵巢切除法制备绝经后骨质疏松症大鼠模型,60只雌性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,雌二醇组(戊酸雌二醇片0.05 mg·kg^-1·d^-1),左归丸低、中、高剂量组(5.5,11,22 g·kg^-1·d^-1)。从造模成功后(第13周)开始,每日灌胃(ig)1次,共持续12周。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠股骨组织结构变化;双能X射线仪检测各组大鼠股骨骨密度(BMD)和骨矿质(BMC);MTS Acumen3型生物力学测试系统检测各组大鼠骨生物力学性能;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中骨碱性磷酸酶(BALP),骨钙素(BGP),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP),Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)等骨代谢标志物含量及雌二醇(E2)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠胫骨组织中Wnt2,β-catenin,低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)水平及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠BMD,BMC,最大载荷和刚度显著降低(P<0.01),血清E2和PINP含量显著降低(P<0.01),BALP,BGP,TRAP含量显著升高(P<0.01),骨组织中Wnt2,p-GSK-3βSer9,LRP5和β-catenin蛋白表达水平显著降低(P<0.01),股骨骨小梁稀疏变细,数量减少;与模型组比较,雌二醇组和左归丸各组BMD,BMC,最大载荷和刚度明显升高(P<0.05,P<0.01),血清E2和PINP含量明显升高(P<0.05,P<0.01),BALP,BGP,TRAP含量显著降低(P<0.01),骨组织中Wnt2,p-GSK-3βSer9,LRP5,β-catenin蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),股骨骨小梁较模型组变粗,数量增加,结构基本清晰。结论:左归丸对去势大鼠骨质疏松症具有一定的防治作用,其机制可能与提高雌激素水平,激活Wnt/β-catenin信号通路,上调Wnt2和LRP5蛋白表达,抑制GSK-3β的活性,减少β-catenin的降解,协调骨形成与骨吸收的动态耦联平衡,纠正骨代谢紊乱,从而改善骨组织形态相关。     

均匀设计优选左归丸提取工艺条件

目的:明确左归丸中总黄酮的提取方法及其含量,为复方左归丸的进一步研究、开发利用提供科学依据。方法:用均匀设计U5(53)表安排左归丸总黄酮的多因素多水平提取实验,以浸膏得率为指标,确定醇提左归丸的数学模型,得出左归丸醇提浸膏得率与各因素之间的回归关系,并推算最佳提取工艺条件。并应用AlCl3-KAc法显色,利用分光光度法以芦丁为对照品对浸膏中总黄酮进行含量测定,对均匀设计结果进行验证。结果:醇提左归丸的最佳工艺条件为:复方左归丸混合粉末质量(g)与加入乙醇体积(mL)的配比=1∶12,乙醇体积分数为55%,提取时间为80 min,浸膏得率的最大值为(69.8±9.62)%。65%乙醇提取左归丸所得浸膏中总黄酮含量最高。结论:用U5(53)法得到的模型方程可在设立的因素水平范围内给出醇提左归丸浸膏得率的极大值,进而探讨各因素对醇提左归丸浸膏得率的影响机制。     

补肾益气方药左归丸和益气聪明汤对老年大鼠学习记忆能力及相关基因表达的影响

目的:观察补肾方药(左归丸)、益气方药(益气聪明汤)及两方合用(合剂)对老年大鼠空间学习能力及学习记忆相关基因表达变化的影响,并探索相关表观遗传酶的变化。方法:以自然衰老(24月龄) SD雄性大鼠为动物模型,随机分为老年组,左归丸组(12. 12 g·kg~(-1)),益气聪明汤组(10. 18 g·kg~(-1)),合剂组(11. 15 g·kg~(-1))和老年皮质酮(glucocorticoid,GC)拮抗组(5×10-3g·kg~(-1)),另设青年组(同品系5月龄)。采用Morris水迷宫法观察各组大鼠空间记忆能力,激光共聚焦法观察各组大鼠大脑海马区乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)与甲基化Cp G岛结合蛋白2(methyl Cp G binding protein 2,MeCP2)的共定位情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织HDAC2,组蛋白乙酰转移酶1(histone acetyltransferase 1,HAT1),糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR),突触蛋白I(synapsin,Syn-1)表达变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测HDAC2 mRNA的表达及各药物对上述指标异常变化的改善作用。结果:与青年组(正常组)比较,老年组(模型组)大鼠潜伏期显著延长(P 0. 05),穿越平台次数显著减少(P 0. 05);与老年组(模型组)比较,左归丸组、益气聪明汤组大鼠潜伏期显著缩短(P 0. 05),穿越平台次数有所增加。与青年组比较,老年组大鼠HDAC2蛋白与mRNA表达显著增多(P 0. 05,P 0. 01),且在细胞核内与MeCP2的共表达明显增多; HAT1,GR和Syn-I表达显著降低(P 0. 05,P 0. 01)。各给药组均能不同程度改善上述指标的异常变化,但益气方药以及两方合剂对HAT1无改善作用。结论:补肾方药左归丸、益气方药益气聪明汤可通过增加老年大鼠学习记忆相关蛋白GR,Syn-1与表观遗传修饰酶HAT1的表达,降低HDAC2的表达,并同时减少HDAC2蛋白与MeCP2的细胞核内共定位,以改善老年大鼠空间学习记忆能力。     

左归丸对去卵巢大鼠下丘脑Orexin及其受体mRNA表达的影响

目的:观察去卵巢骨质疏松症大鼠下丘脑食欲素(Orexin)及其受体mRNA水平,探讨绝经后骨质疏松症(PMOP)的发病机制以及左归丸的作用机制。方法:去势法建立骨质疏松症模型,32只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、雌二醇组和左归丸组,每组8只。灌胃给药12周后,通过显微CT(μ-CT)检测股骨骨密度(BMD)和骨小梁微观三维形态结构,苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠骨组织形态学变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠血清骨转换标志物骨钙素(OCN),I型前胶原氨基端前肽(PINP),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠下丘脑Orexin,食欲素受体1(OX1R)和食欲素受体2(OX2R) mRNA表达水平。结果:与假手术组比较,μ-CT示模型组大鼠BMD,骨体积分数(BV/TV),骨小梁厚度(Tb. Th)和骨小梁数量(Tb. N)显著下降(P 0. 01)而骨小梁间隙(Tb. Sp)升高(P 0. 01),骨小梁明显稀疏,间距加宽,结构出现较大的空白区域; HE染色示骨小梁明显稀少,结构不完整,排列疏松,间距变宽; ELISA示血清OCN,PINP含量降低,TRAP含量升高(P 0. 01);下丘脑Orexin,OX1R,OX2R mRNA表达下调(P 0. 01)。经左归丸治疗后,大鼠BMD,BV/TV,Tb. Th,Tb. N升高(P 0. 05,P 0. 01),Tb. Sp降低(P 0. 01),骨小梁变密,空隙率下降,分布均匀,排列尚可,微观结构明显改善;血清OCN,PINP含量增加(P 0. 05,P 0. 01)而TRAP含量降低(P 0. 01);下丘脑Orexin,OX1R,OX2R mRNA表达明显上调(P 0. 05,P 0. 01)。结论:下丘脑Orexin及其受体mRNA水平降低可能是PMOP发病的机制之一。左归丸可通过上调下丘脑Orexin及其受体mRNA表达,从而纠正骨代谢失衡,改善骨小梁微结构,提高骨密度,发挥治疗PMOP的作用。