组织工程皮肤构建中胎儿皮肤标本玻璃化冻存的实验

目的：建立一种用于细胞培养的皮肤标本新的保存方法。 方法：实验于2004-05-01／2-31在第四军医大学西京医院烧伤外科实验室进行。①分别取流产胎儿头部及躯干部全层皮片（家属知情同意），按照标本保存方法不同分为常规组（4℃保存2h）、冻存1组（-196℃液氮保存1周组）、冻存2组（-196℃液氮保存1个月组）和冻存3组（-196℃液氮保存6个月组）。采用抗冻液4℃下预处理20min后直接快速置于-196℃液氮中的玻璃化冻存方法进行冻存。②分别进行胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的原代培养，进行细胞形态学观察，并采用锥虫蓝染色法、四唑盐比色法和克隆形成实验观察培养的第2代角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的活力。 结果：①与常规组同种细胞相比，冻存1组、冻存2组和冻存3组的胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的形态学特点基本相同。②与常规组相比，冻存1组、冻存2组和冻存3组角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞活细胞率、细胞存活率及克隆形成率差异均无显著性意义（P〉0．05）。 结论：利用液氮玻璃化保存用于细胞培养的皮肤标本不会影响细胞活力，是保持组织活性的一种有价值的组织标本保存方法，对组织工程皮肤的建立，乃至构建组织细胞库有着重要意义。     

X-J心脏保存液对离体心脏不同保存时限ATP及超微结构的影响

目的 :探讨XIJING (X J)超极化保存液对离体兔心低温下不同保存时间再灌注 3 0min后心肌细胞ATP含量及心肌超微结构的影响。方法 :健康大白兔 3 2只 ,随机分成 4组 ,每组 8只 ,Ⅰ组 :低温保存 4h ;Ⅱ组 :低温保存 6h ;Ⅲ组 :低温保存 8h ;Ⅳ组 :低温保存 10h。每组供心均用X J超极化心肌保存液进行低温保存。测定再灌注 3 0min心肌细胞ATP含量及心室肌超微结构 ,比较不同保存时间再灌注后心肌细胞ATP及心肌超微结构的变化。结果 :随着低温保存时间的延长再灌注 3 0min后心肌细胞内ATP的含量无明显的差异 (P >0 0 5 )。从电镜观察来看 ,兔心保存 4～ 6h时心肌纤维排列尚整齐 ,线粒体轻度肿胀 ;在保存 8h后心肌纤维排列紊乱 ,线粒体嵴肿胀 ,个别线粒体出现空泡化 ;10h时心肌组织出现部分心肌细胞坏死 ,细胞器散在于细胞间。结论 :X J超极化心脏保存液在低温保存供心 4～ 6h心肌超微结构变化不明显 ,心脏保存 10h后心肌超微结构改变较 8h明显。     

不同冻存液改善人胎肝细胞冻存质量比较

目的：通过对不同冻存液冻存人胎肝细胞进行比较,探索一种效果较好的冻存液以改善冻存肝细胞质量.方法：实验于2004-08/11在南方医科大学珠江医院中心实验室完成.采用二步灌注法分离人胎肝细胞,将分离后的胎肝细胞分别以3组不同冻存液（HAMF-12,RPMI-1640,DMEM）在液氮中冷冻保存4周.4周后快速复苏胎肝细胞,进行存活率、形态学及尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量检测.结果：①HAMF-12组生存率为（86.0&;#177;2.4）%,明显优于RPMI-1640组（81.9&;#177;6.5）%和DMEM组（82.1&;#177;4.6）%.②HAMF-12组肝细胞极性恢复快,肝细胞生长旺盛,细胞膜完整,胞浆内有丰富颗粒,核仁清楚,少数细胞内出现空泡,与对照组肝细胞形态相似.③用HAMF-12组液冻存人胎肝细胞复苏后,尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量优于RPMI-1640组和DMEM组.结论：①在其他冻存条件相同下,HAMF-12冻存液显著提高了人胎肝细胞冻存质量,优于RPMI-1640液、DMEM液.②复苏后HAMF-12组肝细胞形态学光镜下观察与刚分离的肝细胞无明显差异,进行原代培养后肝细胞极性恢复较好.     

分离胶原始管冻存血清用于酶联免疫吸附试验的可行性探讨

目的探讨用含分离胶的原始样本管冻存血清作为酶联免疫吸附试验（ELISA）的标本的可行性。方法采用ELISA法对分离胶管采集的61例血清样本测定乙肝两对半、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体等指标,检测完后分别用样本原始管冻存血清及用聚苯烯管分离血清冻存,两者冻存6个月后,再检测上述指标,比较两者的结果。结果用分离胶原始管冻存血清与用聚苯烯管分离血清冻存的定性结果及S/CO值比较差异均无统计学意义。结论用离心后的分离胶原始样本管冻存血清进行ELISA检测是可行的。     

Adenosine 5＇triphosphate transport and accumulation during the cold preservation of rat hepatocytes in University of Wisconsin solution

AIM: We used isolated hepatocytes to investigate how different concentrations of ATP in the University of Wisconsin (UW) solution affected both cellular ATP content and cell viability during the cold storage and the rewarming step. The mechanism involved in ATP transport and accumulation in hypothermia was also determined. METHODS: The cells were preserved up to 72 h in different conditions: UW solution without ATP (a-group), UW+5 mmol/L ATP (b-group), and UW+10 mmol/L ATP (c-group). The ATP content and the cell viability (LDH release) were determined during the cold storage and the rewarming step. In the groups a and c, the respiratory function of the cells at rewarming was studied. In addition, the cell volume of hepatocytes and the mechanism involved in ATP transport and accumulation were assessed. The extracellular degradation of exogenous nucleotides during transport experiments was investigated by a HPLC technique. RESULTS: After three days of cold storage a loss of cellular ATP content was observed in hepatocytes preserved either without nucleotides (a-group) or with 5 mmol/L ATP (b-group). In contrast, 10 mmol/L ATP (c-group) was able to maintain a normal ATP cellular content, with only a 6% diminution after 72 h of cold storage. The respiratory function was significantly different in hepatocytes preserved with 10 mmol/L ATP than without ATP. No significant change was detected For the three groups in cellular volume during the cold storage. We also report that the time course accumulation of [3H]-ATP by cold stored hepatocytes is a rapid process that is completed after 180 s with linear dependence on the extracellular ATP concentration (linear fitting results in a slope of 0.5624±0.1179 mmol/L ATP intracell/mmcl/L ATP extracell). CONCLUSION: Our results show that, during hypothermic storage in UW solution, hepatocytes are permeable to ATP by a diffusive mechanism. Also, we found that it is ATP the main extracellular nucleotide available for transport and it is not the breakdown products.     

人动脉的低温-深低温序贯保存

目的 通过观察低温及深低温保存后移植血管的细胞代谢活性及组织结构变化情况,探讨低温-深低温序贯保存人体血管的可行性与安全时限. 方法 取人的髂动脉和脾动脉,于4℃UW液中分别保存72 h、1周、2周、3周和4周,得到的血管一部分分别行氯化硝基四氮咗蓝(NBT)染色和HE染色.另一部分继续于-80 ℃下深低温冻存4周,复温后分别行NBT染色和HE染色,光镜及电镜下观察血管组织和细胞结构变化. 结果 冷保存2周时的血管NBT染色时间的差异无统计学意义(P＞0.05);冷保存后1周,冻存前后的染色时间的差异无统计学意义,冻存者的染色时间与新鲜血管比较,差异也无统计学意义(P＞0.05).随着4℃冷保存时间的延长,血管组织结构的破坏加重,当保存时间超过2周时.血管损伤更加明显及严重;4℃下保存越久的血管,再行-80℃冻存后其超微结构破坏越重,当4℃下保存时间超过1周时,血管损伤更加明显及严重. 结论 4℃UW液冷保存人体动脉的安全时限为2周;4℃UW液冷保存1周以内的血管再行-80℃深低温冻存,其细胞代谢活性与组织结构保持良好.     

保存人参有诀窍

柯大夫:前段时间,朋友去东北旅游,回来给我带了一些人参,据说比较名贵。我想问问人参该如何保存呢?海南韩×韩读者:人参是补药之王,具有大补元气、补脾益肺、生津安神等作用,可泡茶、冲粉、含化、炖服。在保存过程中,因人参含有较多糖类、黏液质和挥发油等,所以,容易受潮、     

矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究

目的观察矿化诱导培养能否促进冻存骨髓基质细胞（BMSCs）在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原,为牙周组织工程中选择适宜的种子细胞的保存和培养条件提供参考。方法体外分离培养Beagle犬BMSCs,经冻存12个月后,在矿化诱导培养液（矿化诱导组）或基础培养液（非矿化诱导组）中形成BMSCs-胶原膜支架复合物,将矿化诱导培养液处理的单纯胶原膜支架（空白对照组）、2种BMSCs-胶原膜复合物分别植入裸鼠背部皮下组织中,术后第4周行组织病理学和免疫组织化学观察,分析各组标本中的Ⅰ型胶原形成量。结果空白对照组植入胶原膜后,新生胶原分布很少;非矿化诱导组胶原分布明显增多;矿化诱导组中见大量新生的胶原形成。免疫组织化学光密度测量显示,矿化诱导组（0.1963±0.0126）〉非矿化诱导组（0.1489±0.0037）〉空白对照组（0.0775±0.0058）（P〈0.05）。结论矿化诱导培养能够促进冻存的BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原。     

人视网膜色素上皮细胞原代培养冻存和复苏方法改进

目的 优化建立一种简单有效的人视网膜色素上皮细胞(RPE)的原代培养、冻存和复苏的方法,对细胞进行鉴定,为研究RPE 的功能和治疗有关眼病提供细胞来源.方法 采用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)二次消化分离细胞并进行传代,以0.125%胰酶进行传代,用免疫组织化学检测进行角蛋白与S100 表达鉴定RPE.利用-80 ℃冰箱对细胞冻存,复苏后观察细胞活性.结果 RPE 体外生长旺盛、1 h 贴壁.初期为圆型,胞壁内充满黑色色素,传代后细胞呈圆型、不规则形,细胞透亮.免疫组织化学角蛋白与S100 均呈强阳性,证实培养的是RPE 细胞,所获细胞纯度100%.冻存细胞复苏后生长旺盛,细胞形态与复苏前相比无区别.结论 二次胰蛋白酶消化分离细胞数量多,能成功建立RPE 的体外培养模式,用-80 ℃冻存RPE 的方法简便,成本低,冻存复苏后细胞存活率及细胞形态不受影响,是目前较理想的RPE 细胞保存方法.     

肝细胞低温保存的实验研究

在传统的冻存剂配方的基础上,通过降低DMSO的浓度并且添加不同浓度的葡萄糖、蔗糖或海藻糖,探索一种改善人肝细胞冻存效果的新冻存保护剂配方.在传统的冻存保护剂配方中,将DMSO的浓度降低至2% v/v或5%v/v,加人葡萄糖、蔗糖或海藻糖;两周后将肝细胞快速复温,进行存活率、24 h贴壁率和形态学的检测,并与10%DMSO对照,其中5%DMSO+0.3 mol/mL海藻糖组效果最好,复温后肝细胞的存活率、24 h贴壁率均优于其它冻存液组.结果表明,葡萄糖、蔗糖、海藻糖均对人肝的低温保存有一定的保护作用,5% DMSO+0.3 mol/mL海藻糖组是其中最好的浓度配方;海藻糖与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用.