嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应用研究

根据嗜肺军团菌基因组ＤＮＡ的种特异性ＤＮＡ片段序列，合成一对引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。经琼脂糖凝胶电泳、ＥＢ染色结果表明，一条８７０ｂｐ的核苷酸区带为嗜肺军团菌１～１４血清型菌株所共有。ＰＣＲ检测水中军团菌，其敏感性为３５０ｃｆｕ／ｍｌ，而用同位素标记探针、斑点杂交法检测，其敏感性为４３ｃｆｕ／ｍｌ。ＰＣＲ检测人工感染嗜肺军团菌的豚鼠组织标本，阳性率为８３．３％，而细菌分离培养的阳性率仅为２６．６％。在现场调查中，用ＰＣＲ法初步验证了一起由Ｌｐ１０引起的军团菌病爆发。上述结果表明，ＰＣＲ法能快速、敏感、特异性检测嗜肺军团菌感染。     

Fluorotyping of HLA-C: differential detection of amplicons by sequence-specific priming and fluorogenic probing

Conventional PCR-SSP, which is based on an agarose gel-based read-out, has the disadvantages of time-consuming post-PCR steps and low potential for automation. The aim of our study was to sort out these drawbacks by establishing a fluorescence-based PCR-SSP system for HLA-C. The assay relies on the sequence-specific identification of amplicons with individually labeled probes that are cleaved during successful PCR by the 5'-3' exonuclease activity of the Taq-DNA Polymerase. The oligonucleotides are labeled with a unique and spectrally resolvable fluorescent reporter dye at the 5' terminus (FAM or TET) and a common quencher dye at the 3' terminus (TAMRA). In case of amplification, the reporter escapes from the quenching control caused by the physical separation of the dyes, resulting in a significant increase of the reporter fluorescence. This allows simultaneous and differential detection of the specific HLA (FAM) and internal control (TET) product. The HLA-C fluorotyping information is based on the individual reporter fluorescence released by 18 PCR primer mixes. Using this method, we analyzed 145 samples previously typed with conventional PCR-SSP and found a concordance rate of 100%. Furthermore, fluorotyping revealed quantitative results that may indicate the presence of homozygosity by high signal intensities. This provided extra protection not to miss new alleles which are not amplified by the current primer mixes. These features as well as the capability of high sample throughput and the possibility of automation makes fluorotyping an attractive tool for PCR-based HLA typing.     

采用基因配型行同种异体肾移植术

目的 探讨基因配型技术在同种异体肾移植中的应用。方法采用顺序特异引物聚合酶链反应法(PCR-SSP)分别进行供、受体的基因分型，为3例配型适当的终末性肾病患者行同种异体肾移植术，并观察其术后肾功能恢复情况。结果所有接受肾移植的患者于术后2d肾功能恢复至正常水平，无急性和超急性排异发生。随访11-15个月，各项检查指标均正常。结论 基因配型的准确率较之传统的血清学配型显著增加，显著提高同种异体肾移植的成功率。     

乙肝病毒DNA阳性患儿家族成员的调查

本文对１４例ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性患儿的家庭成员２３人进行血清学检测，并收集２２例正常人血清为对照组。２３例家庭成员中ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率为３４．８％（８／２３），明显高于对照组４．５％（１／２２），Ｐ＜０．０１。ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率在患儿的双亲为４０％（４／１０），而在其祖父母辈为３３．３３％（３／９），二者无显著差异（Ｐ＞０．０５）。提示乙肝病毒感染的家庭聚集性存在双亲或祖父母辈与患儿间的易感性相似。     

肝癌组织辅助性T细胞-2细胞因子强势分泌研究

目的　探讨人肝癌组织中辅助性T细胞亚群 (Th1/Th2 )细胞因子表达模式。方法　收集我科手术切除肝癌组织标本 15例 ,肝良性疾病或肝硬化门静脉高压手术患者肝组织标本 15例作为对照 ,β 肌动蛋白 (β actin)作为参照 ,采用半定量逆转录 聚合酶联反应 (RT PCR)方法检测人肝癌组织中γ 干扰素 (IFN γ)和白细胞介素 4(IL 4)mRNA的表达。结果　人肝癌组织中IFN γmRNA表达 (相对数 :1.18± 0 .3 1)比对照组肝组织中IFN γmRNA表达弱 (相对数 :1.86±0 .5 0 ) ,而IL 4mRNA表达 (相对数 :1.73± 0 .5 1)比对照组强 (相对数 :0 .94± 0 .41,P <0 .0 5 )。结论　人肝癌组织中Th1类细胞因子表达弱 ,Th2类细胞因子表达强 ,呈现Th2细胞因子表达模式 ,肝癌组织局部微环境处于免疫抑制状态 ,肿瘤细胞易发生免疫逃逸     

耐万古霉素肠球菌表型及基因型分析

目的：对耐万古霉素的肠球菌进行表型及基因型分析，了解临床耐万古霉素肠球菌(VRE)的流行状况。指导临床合理使用抗生素。方法：48株肠球菌，按常规方法进行鉴定，并采用琼脂筛选法对耐万古霉素肠球菌进一步筛选。将筛选出的3株耐万古霉素肠球菌，以多重PCR法进行基因分型。结果：共检出3株对万古霉素耐药肠球菌，其中1株为天然耐万古霉素株。基因型分析结果为1株VanA型，1株VanCl型，另1株基因型不明。结论：已发现3株VRE。临床应合理使用抗生素，以防止VRE的爆发流行。     

视蛋白基因启动子的克隆和鉴定

目的 克隆出视蛋白基因启动子。方法 以小鼠全基因组为模板，用PCR法克隆出目的大小的片断。然后连接到T-载体上作酶切鉴定，最后测序。结果 酶切结果与预期相符，测序结果与公布序列完全一致。结论 视蛋白基因启动子克隆成功。     

性激素受体及相关生长因子在前列腺基质细胞中的表达

目的：探讨前列腺基质增生的发病机制与性激素以及相关生长因子的关系。方法：应用RT－PCR的方法研究了在人前列腺不同细胞类型中Smoothelin的表达，研究了雄、雌激素受体及相关生长因子在前列腺基质细胞中的表达，以及它们在前列腺基质细胞分化中表达的变化。结果：Smoothelin是前列腺平滑肌细胞特异性的标记蛋白；雄激素受体（AR）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、角化细胞生长因子（KGF）主要在前列腺成纤维细胞中表达，而雌激素受体（ER）、转移生长因子β1（TGFβ1）主要在平滑肌细胞中表达。结论：前列腺基质增生与雌激素受体和转移生长因子β1的过度表达密切相关。     

人部分正常与肿瘤细胞株中neuritin表达的检测

目的:筛选neuritin高表达及低表达细胞株,为进一步探讨neuritin在不同组织细胞生长发育过程中的作用奠定基础.方法和结果:分别利用RT-PCR与免疫组化技术在mRNA水平及蛋白水平,检测了11种人类细胞株中neuritin的表达情况,发现不仅在多种正常细胞中有表达,而且在部分肿瘤细胞中也有表达.结论:成功筛选出了neuritin高表达及低表达细胞株.     

脑胶质瘤白细胞介素-6自分泌或旁分泌环路的研究

目的　研究白细胞介素 6(IL 6) /IL 6受体 (IL 6R)自分泌或旁分泌环路与脑胶质瘤的关系。方法　采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测IL 6和IL 6R基因在 4株脑胶质瘤细胞株、62例脑胶质瘤组织标本、5例良性脑膜瘤组织和 5例人正常脑胶质细胞中的表达 ;将IL 6单抗 (McAb)或IL 6RMcAb与脑胶质瘤细胞共同孵育 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测对细胞生长的抑制作用。结果　脑胶质瘤细胞株C6、9L、U 2 5 1和SHG44均有IL 6和IL 6R的表达 ,脑胶质瘤组织标本中 47例 (75 .81% )表达IL 6、5 2例 (83 .87% )表达IL 6R、41例 (66.13 % )同时表达IL 6和IL 6R ;良性脑膜瘤组织 4例表达IL 6,人脑正常胶质细胞仅有IL 6弱表达 ,两者均无IL 6R表达。IL 6McAb和IL 6RMcAb能够显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖 ,并存在剂量依赖关系(P <0 .0 1)。结论　脑胶质瘤很可能存在IL 6/IL 6R自分泌或旁分泌环路 ,阻断此环路可以明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖