Ⅰ型登革病毒NS1抗原捕获ELISA的建立和初步临床诊断应用

目的以登革病毒特异性非结构蛋白1（NS1）单克隆抗体为基础建立Ⅰ型登革病毒（DEN1）抗原检测的酶联免疫吸附（ELISA）法，并探索从病人早期血清样品中检测DEN1-NS1的可行性。方法利用已制备的抗DEN1-NS1单克隆抗体（单抗），进行多种抗体组合配对优化模式的分析，建立双抗体夹心抗原捕获ELISA，以469份健康人血清样品确定cut off值，检测DEN1感染患者急性期血清样品。结果对多种抗体组合反复筛选，最终确立了最佳的包被单抗和酶标测定单抗，建立了抗体夹心捕获DEN1-NS1抗原的酶联免疫测定方法，能特异检测DEN1，与其他血清型登革病毒不发生交叉反应。检测16例临床确诊DEN1感染病人急性期血清样品，15例呈特异的抗原反应阳性。结论成功建立了DEN1-NS1抗原捕获ELISA并应用于临床血清样品的检测，为登革热的早期实验室诊断提供技术方法。     

天然罗汉松二萜体外抗登革病毒活性研究

登革病毒(dengue virus,DENV)是造成热带和亚热带地区登革热和登革出血热季节性大爆发的蚊媒病原体,可导致严重威胁生命的疾病,因此亟需研发DENV疫苗和药物。本研究发现从石栗枝叶中分离的罗汉松型二萜(3α,5β,10α)-13-methoxypodocarpa-8,11,13-triene-3,12-diol(MPTD)具有很强的体外抗DENV作用。噬斑抑制实验检测MPTD对4种不同血清型DENV的抑制作用;MTT实验检测其对Vero和Huh7两种细胞的毒性;qRT-PCR和Western blot实验分别在RNA和蛋白水平检测其抗DENV的活性。结果表明,MPTD处理可显著降低DENV感染Vero细胞的病毒滴度,其对4种DENV(1~4)的半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)值分别为2.72±0.39、10.99±5.18、18.72±0.21和0.48±0.28μmol·L^-1。MPTD显著抑制DENV RNA的合成和E蛋白的表达,其可能抑制DENV复制的前期阶段而发挥抗病毒活性。进一步的研究显示,MPTD对DENV感染的抑制作用不是靶向病毒进入细胞阶段。MPTD对DENV具有显著抑制作用,是一种有潜在应用价值的抗DENV化合物。     

携带荧光素酶登革亚病毒颗粒的构建和鉴定

目的 拟将荧光素酶基因整合入登革病毒（DENV）亚病毒颗粒（RSPs）中,构建能用于抗体介导的感染增强（ADE）高通量筛选的研究工具。方法 将荧光素酶基因luciferase插入DENV包膜蛋白基因prME的3'端,取代prME第二个跨膜区,构建prME-luc融合基因。用prME-luc融合基因转染293T细胞,在上清中检测携带荧光素酶的登革亚病毒颗粒（RSP-luc）。结果 转染prME-luc的293T细胞可以将RSP-luc释放至培养上清中,共转染野生型prME能够提高RSP-luc的产量。Western-blot技术确认了RSP-luc中含有DENV包膜蛋白和荧光素酶形成的融合蛋白。RSP-luc易于制备并可通过超速离心分离纯化,且可通过测定荧光素酶活性快速定量。体外实验显示RSP-luc能够与Vero细胞、U937细胞以及小鼠腹腔巨噬细胞等DENV靶细胞结合,结合过程可被受体类似物硫酸肝素竞争性抑制,也可被DENV特异性抗体4E11增强。结论 RSP-luc 能够模拟DENV 感染过程,有望成为深入研究DENV 与宿主相互作用及ADE 发生机制的有效工具。     

Ⅰ型登革病毒感染后不同病程病毒核酸及其IgM抗体的变化规律

目的 探讨Ⅰ型登革病毒感染后病毒核酸及其IgM抗体在患者体内的变化规律,为指导临床快速、准确地诊断登革热提供理论支持.方法 回顾性分析2014年7-11月收集的Ⅰ型登革病毒感染者临床资料和血清标本,应用实时荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测病毒核酸和IgM抗体,分析不同病程两者的变化规律.结果 共检出222例阳性患者,其中病毒核酸阳性137例,IgM抗体阳性146例,两者同时阳性61例.病程急性期(发病l～5d)病毒核酸阳性率为75％ ～ 100％,IgM抗体阳性率在发病第1～2天较低,但第3～5天快速升高至50％ ～ 70％;进入恢复期(发病6～10 d)病毒核酸阳性率即快速降低,8d后仅20％左右,但IgM抗体阳性率显著升高达95％～100％.急性期和恢复期病毒核酸与IgM抗体检测结果构成比差异有统计学意义(x2=63.41,P＜0.05).结论 Ⅰ型登革病毒感染者急性期病毒核酸阳性率在75％以上.恢复期IgM抗体阳性率在95％以上.根据病程合理选择检测方法,可提高登革热的诊断效率.     

抗病毒免疫信号通路在蚊抗登革病毒感染中的研究进展

登革热是一种虫媒传染病,在热带和亚热带100多个国家流行,其病原体为登革病毒,感染登革病毒的部分患者可发展为严重的登革出血热和登革休克综合征。在登革热的传播媒介伊蚊中,登革病毒随血液被蚊虫吸入中肠进行复制。新形成的病毒颗粒分散到不同的器官或组织增殖,最后进入唾液腺,再次通过蚊虫叮咬传播到下一个宿主。感染期间,蚊对病毒的识别触发了它们的抗病毒天然免疫反应,从而抑制病毒复制。然而,蚊虫的免疫系统只限制病毒的复制,却不完全清除病毒。因此,蚊终生携带病毒使得病毒能够持续性感染。本综述对蚊抗登革病毒天然免疫信号通路最新研究进行总结,有助于研发有效的抗病毒药物和登革热疫苗,更好地预防和控制登革热。     

登革病毒IgG抗体的检测:基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

目的 建立基于登革病毒E蛋白特异性抗原的荧光素酶免疫吸附法（DENV-LISA）,用于检测DENV IgG抗体。方法 分别构建DENV1-E1、DENV2-E2与荧光素酶的融合表达质粒,转染293T细胞后获得含特异性抗原与荧光素酶的融合蛋白,建立DENV-LISA,评价其特异度和灵敏度,并与商用登革病毒IgG抗体检测试剂盒比较。结果 DENV-LISA阳性检出率32.4%,特异度96.6%,商用检测试剂盒阳性检出率35.3%,差异无统计学意义（P>0.05）;阳性样本稀释6400倍可判断阳性,灵敏度高;同批板间、板内检测值差异无统计学意义（P>0.05）;重复性良好。结论 建立基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法,对登革病毒IgG抗体有较高特异度和灵敏度,可用于登革病毒感染的早期筛查、监测预警、流行病学调查等。     

深圳市福田区2014年登革热疫情流行病学特征分析

目的 分析2014年深圳市福田区登革热疫情流行病学特征,探讨预防控制措施.方法 对各医院报告的福田区病例进行流行病学个案调查,采集病例血液样本开展血清学或病原学检测,并划定疫点进行蚊媒调查和病例搜索.结果 深圳市福田区2014年报告登革热病例87例,发病率6.52/10万,无死亡病例;发病高峰出现在10月份,当月气温徘徊在25～30℃,适宜白纹伊蚊生长;男女性别比为1:0.47;发病年龄最小13岁,最大67岁,以青壮年为主.全区有2个暴发点,病毒型别主要为登革热Ⅰ型.疫情发生时布雷图指数最高达140.结论 深圳市福田区存在登革热流行的基本条件,疫情存在着明显的季节性、人群对登革热普遍易感等特征.有效控制疾病传播媒介白纹伊蚊是控制疫情的根本措施,疫情的早发现早报告也是有效控制措施之一.     

珠海市2012～2013年登革病毒基因特征研究

目的:测定珠海市2012~2013年登革病毒的E基因序列,探讨其来源和基因型。方法:采集2012~2013年珠海登革热疑似病例的所急性期血清184份,采用荧光RT-PCR检测登革病毒核酸,取19份登革病毒核酸阳性标本扩增E基因并测序分型。结果:16例标本属于DVⅠ型,3例标本属于DVⅡ型。DVⅠ型同源性与2008年新加坡、越南等地DVⅠ型流行株接近,DVⅡ型同源性与2013年新加坡、马来西亚等地DVⅡ型流行株接近。结论:2012~2013年珠海市DV流行主要以Ⅰ型为主,近几年珠海市DV流行方式属于东南亚国家输入性病例引起的本地流行。     

登革病毒悬液芯片分型检测方法的建立

目的 建立一种基于悬液芯片的登革病毒(dengue virus,DV)检测方法,可对四种血清型登革病毒进行快速检测和鉴定.方法 依据GenBank上4种病毒的基因序列信息,设计并合成相关引物及探针序列.抽提病毒RNA,经反转录后对目的基因进行PCR扩增,产物与核酸探针微球组杂交后于Bio-PlexTM 200系统检测荧光信号值.结果 DV1的悬液芯片检测敏感性约9 DNA拷贝,DV2、DV3、DV4的悬液芯片检测敏感性约90 DNA拷贝.进而将本方法用于检测15份临床标本,其检测结果与分型荧光RT-PCR一致.结论 建立了可同时检测四种血清型登革病毒的悬液芯片检测方法,为快速筛查和鉴定登革病毒提供了新的手段.     

登革病毒血清型2 E蛋白Ⅲ区单克隆抗体的制备及其诊断特异性研究

本研究旨在制备抗登革病毒(dengue virus,DENV)血清型2 (DENV2)E蛋白Ⅲ区(envelope protein domainⅢ,EDⅢ)单克隆抗体(简称单抗)并研究其诊断特异性。合成编码DENV2-EDⅢ的基因并将其克隆入原核表达质粒pET21a;将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21;用重组表达的EDⅢ免疫小鼠;将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合;将可产生识别抗EDⅢ单抗的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔;采用蛋白G亲和层析法从腹水中纯化单抗;采用间接ELISA和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)评估所制备的单抗识别DENV血清型1～4 (DENV1～4)的能力。本研究成功表达了DENV2-EDⅢ,并制备出3株杂交瘤细胞,杂交瘤细胞所分泌的小鼠源性单抗既可识别DENV2,又可交叉识别DENV1、DENV3和DENV4。