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101.
目的 构建含TK自杀基因的质粒表达载体并进行转染研究。方法 根据已发表的Hsv-TK基因的核苷酸序列,设计并合成一对引物,以含TK基因的PGEM/TK质粒为模板扩增出TK基因全长CDS序列,将其克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,进行序列分析和酶切鉴定后,运用电穿孔法将重组体pCDNA3.1(-)CMV-CD车专人鼻咽癌CNE-2细胞中,观察其表达情况以及无毒前体药物GCV干预下对CNE-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和序列分析证明pcDNA3.1(-)(2MV.TK含完整的TK基因序列,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出预期片段;鼻咽癌CNE-2细胞在无毒前体药物GCV干预下,其生长受到抑制。结论 成功构建了质粒载体pcDNA3.1(-)CMVTK,可以将其作为鼻咽癌自杀基因治疗的一种载体。 相似文献
102.
血管内皮生长因子在急性白血病细胞株的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 探讨血管内皮生长因子 (Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受体 (VEGFR)KDR ,Flt - 1在急性白血病细胞株NB4、K56 2、HEL ,Jurkat、HL - 6 0 ,THP的基因表达情况 ,为进一步研究急性白血病治疗的抗肿瘤靶点提供思路。方法 采用RT -PCR和酶联免疫吸附法 ,对 6种急性白血病细胞系肿瘤细胞进行VEGF及其受体的基因型和表型检测。结果 6种白血病细胞系均 ( 1 0 0 % )检测到VEGF基因表达 ,强度不同 ,其中 3种细胞株 ( 50 % )检测到受体Flt- 1基因表达 ,所有细胞株均未检测到受体KDR基因表达 ;6种急性白血病细胞株上清液中VEGF浓度都明显高于对照。结论 VEGF及其受体在白血病细胞表达 ,说明VEGF及其受体在白血病的发生、发展中起重要作用 ,是急性白血病特征之一。 相似文献
103.
目的建立转人白细胞介素-15(hIL-15)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-15的表达情况。方法将携带人白细胞介素-15的质粒pcDNA3.1( )-hIL-15转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Westernblot和ELISA法对hIL-15的表达进行检测。结果IL-15基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达。RT-PCR电泳结果显示hIL-15基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-15的含量为(185.0±12.2)pg/ml,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-15。结论hIL-15基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达。 相似文献
104.
105.
目的:探讨KA I l基因的表达与食管癌发生及浸润转移的关系。方法:采用RT-PCR及免疫组化方法,检测食管癌组织及其正常粘膜中KA I lmRNA及蛋白的表达。结果:KA I lmRNA的表达在食管癌组织和其正常粘膜中未见显著性差异,且与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移无关;KA I l蛋白在癌组织中的表达明显低于其正常粘膜,在有淋巴结转移病例中的表达明显低于无淋巴结转移病例,但与肿瘤的分化程度、浸润深度无关。结论:食管癌癌变和转移可能与KM I1蛋白的低表达有关,但与KA I lmRNA的表达无关,推测这可能是由于翻译后修饰所致。 相似文献
106.
目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。 相似文献
107.
目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-12)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E.Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性。 相似文献
108.
IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:研究人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法:利用PCR方法扩增出mhIL-18基因,构建融合型表达载体pPTYB1-IL18,转化入大肠杆菌ER2566中,IPTG诱导表达,优化表达条件,超声裂解细胞,采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达,亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果:成功构建载体并转化入ER2566后,经IPTG诱导,表达量可占菌体总蛋白的26%以上,其中80%以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,具有显著的IL-18的生物学活性。结论:成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18,并具有显著的IL-18的生物学活性。 相似文献
109.
目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1( )AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1( ),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1( )AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。 相似文献
110.
苦参碱对C6胶质瘤细胞的增殖和原癌基因表达的影响 总被引:10,自引:1,他引:10
目的:本研究拟探讨苦参碱对胶质瘤细胞株(C6细胞株)的抑制作用及其作用机理.方法:应用MTT比色法检测不同浓度苦参碱对C6细胞的增殖抑制,应用流式细胞仪观察苦参碱对C6细胞周期的影响,应用RT-PCR观察原癌基因C-myc表达的变化.结果:苦参碱对C6细胞增殖抑制作用呈剂量依赖性,当浓度为0.20g/L时,对C6细胞增殖的抑制率达到(53.8±5.6)%.流式细胞仪分析显示,用0.20g/L苦参碱培养3 d,细胞周期中G0/G1期所占比例增加,S期占细胞周期的比例降低.RT-PCR结果显示,随着苦参碱作用剂量的增加,C-myc基因的表达被明显抑制.结论:苦参碱对大鼠胶质瘤细胞系C6的增殖具有明显的抑制作用,并对原癌基因C-myc的表达具有抑制作用. 相似文献