心脏组织工程瓣脉动流培养系统的设计与构建

自行设计和制造平面和三维立体培养室及贮液室等构件,用医用硅胶管连接;转子泵作为动力源,贮液室通气口供给5%CO2 95%空气,恒温水浴箱保持构件37℃恒温,这样组成了种植细胞与生物瓣支架复合体的脉动培养系统,并进行生物力学和生物相容性测试,为心脏组织工程瓣的体外构建提供研究器材。结果显示,该装置密闭性能好,内环境能保持37±1℃、CO2浓度5%±1%、pH值6.8～7.5;流量在0.125～6.0L/min的范围内任意调节;同种瓣膜上的内皮细胞经2周培养后扩增约10倍;瓣膜支架的细菌和霉菌培养均为阴性,说明我们构建的脉动流培养系统能有效地模拟体内脉动流场实现种植细胞在体外的增殖、重塑,为心脏组织工程瓣的体外构建提供了一种新的实验方法。     

人TCA-12-2/TCB-7.1真核双表达载体的构建与表达

目的：将T细胞抗原受体基因TCA-12-2和TCB-7.1共同构建在真核表达载体pDC315，用于哺乳动物细胞293转染研究。方法： 将分离得到的淋巴细胞总RNA反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到TCA-12-2基因；以实验室保存含TCB-7.1基因的质粒为模板，扩增得到TCB-7.1基因。随后酶切，连入载体pIRES2-AcGFP1，通过亚克隆连入载体pDC315，得到重组质粒pDC315-TCA-12-2-TCB-7.1。重组体质粒经酶切鉴定后，并对插入的TCA-12-2和TCB-7.1基因片段进行测序，将鉴定好的阳性重组质粒用脂质体介导转染293细胞，并通过RT-PCR和流式细胞仪检测TCA-12-2和TCB-7.1基因的表达情况。结果： TCA-12-2和TCB-7.1可以同时构建在载体pDC315上，RT-PCR和流式细胞仪检测发现TCA-12-2和TCB-7.1基因可以成功在293细胞上表达。结论：成功构建了含TCA-12-2和TCB-7.1基因的双表达载体。     

第三代腺病毒载体重组构建的优化

第三代腺病毒载体以其高容量、长时间转基因表达及低毒性和低免疫原性的优点已经广泛应用于基因治疗中，目前这种病毒载体的重组构建已经有许多优化和改进。[编者按]     

细胞色素P450 1A1cDNA表达质粒的构建及转基因细胞系的建立

将ＣｙｔＰ４５０１Ａ１ｃＤＮＡ片段亚克隆至哺乳动物细胞高表达型穿梭载体中，酶切图谱显示片段被正向克隆于多克隆位点中。运用电穿孔法将重组质粒转入人羊膜ＦＬ细胞中国仓鼠ＣＨＬ及Ｖ７９细胞中，经Ｇ４１８筛选３周后获得抗性细胞克隆，并扩大成系。     

人IL-31基因克隆、表达及在皮肤炎症中的作用

目的 克隆人IL-31基因,构建原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达,研究hIL-31蛋白与皮肤炎症的关系.方法 采用RT-PCR克隆人IL-31基因,将其克隆到原核表达载体pET28a( ),并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达,用该目的蛋白刺激人表皮角质细胞HaCaT,RT-PCR检测趋化因子MIP-3β、TARC及TCA-3(I-309)mRNA的表达;小鼠皮内注射该目的蛋白,观察局部炎症表现,皮肤标本HE染色观察皮肤炎性特征,采血进行白细胞计数及分类,ELISA法检测血清IL-1βIL-6和TNF-α水平,流式细胞仪分析胸腺及脾脏T细胞亚群.结果 成功获得495bp的人IL-31基因,原核表达质粒构建正确,IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达;该目的蛋白可刺激HaCaT表达趋化因子MIP-3β、TARC、I-309;小鼠皮肤注射部位有脱毛,HE染色可见炎性细胞浸润,外周血白细胞总数增加,中性粒细胞比例增高,血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高,脾脏CD4 T细胞百分比增高,CD8 T细胞百分比减少.结论 人IL-31基因克隆及原核表达已获成功,hIL-31蛋白可刺激HaCaT细胞表达MIP-3β、TARC、I-309,诱导小鼠皮肤炎症反应.     

微小隐孢子虫CPl5基因高效真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的：构建隐孢子虫CP15真核表达载体pCB3．1—15，观察其在Hela细胞中的表达。方法：用BglⅡ从pMD18-T-15中酶切得到CP15基因，将其插入真核表达载体pCR3．1( )的BamH I位点，构建CP15真核表达载体pCR3．1—15，脂质体介导法将其转染Hela细胞，并用G18加压筛选，用RT—PCR方法检测外源CP15基因的转录，用ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果：酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3．1-15；外源CP15基因能在转染细胞中有效转录；ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性。结论：构建的pCR3．1—15真核表达载体在Hela细胞中具有良好的表达活性。     

酵母双杂合系统AD端阴离子交换蛋白C-末端表达质粒的构建

利用PCR方法，从阴离子交换蛋白1（AE1）全长cDNA中扩增出约350bp c末端cDNA片段，测序后将其克隆至pGADT7载体上，用醋酸锂法构建好的pADT7-AE1-c末端转染酵母菌HA109，观察其在选择性培养基上的表达情况。结果表明，获得了530bp AE1c－末端cDNA,pGADT7-AE1-c末端对酵母无毒性，不能激活检测基因，可作为酵母双杂合系统中的靶基因。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的Id2真核表达载体构建

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体，为骨骼肌的组织工程研究提供有效的分子工具。方法：利用RT-PCR的方法扩增出Id2全长cDNA，利用T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接，构建克隆载体，经限制性内切酶EcoR1酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGF-C2真核表达载体，构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2，经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性；并通过细胞转染技术将Id2基因导入L6成肌细胞中。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段，获取了转染外源性Id2基因的L6细胞。结论：我们成功构建了同时携带有G418筛选位点和增强绿色荧光蛋白的Id2真核表达载体？     

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.