人心肌肌球蛋白的提取、纯化轻链成份的制备及其理化性质

采用比较简便、有效的提取方法,从150g人心肌中得到660mg肌球蛋白粗品,经DEAE-Sephadex A-50纯化后得到纯肌球蛋白320mg,比活力达5.05u/mg蛋白,酶活力回收36％。进一步以纯肌球蛋白制得电泳纯的心肌肌球蛋白轻链,并以之免疫新西兰兔而获得抗人心肌肌球蛋白轻链的抗血清。抗血清具有较好的特异性,亲和常数为1.16×10~9M~(-1);当稀释度为1:2000时,可用于酶联免疫吸附分析。此外,还测定了心肌肌球蛋白及其轻链成份的理化特性和酶反应动力学特征。     

缺氧及缺氧-复合运动大鼠比目鱼肌肌球蛋白重链组成变化

 目的： 观察缺氧及缺氧复合运动条件下大鼠比目鱼肌肌球蛋白重链(MHC)异构体组成的变化。方法: Wistar大鼠随机分为4组：平原对照组、缺氧组、平原运动组和缺氧复合运动组。缺氧复合运动组大鼠持续暴露于模拟海拔5 000 m高原5周，每天降至4 000 m高原进行游泳运动1 h（6 d/week），运动结束后回升至5 000 m；缺氧组大鼠同时在低压舱内相同海拔高度饲养，但不进行游泳运动；平原运动组和平原对照组在舱外同时饲养，其中平原运动组每天进行游泳运动1 h（6 d/week）。在末次运动结束后24 h处死大鼠，分离后肢比目鱼肌。用含30%甘油的SDS-PAGE电泳分离比目鱼肌MHC异构体，观察MHC异构体组成变化。结果: 平原游泳运动大鼠比目鱼肌重量指数增加，而缺氧复合运动组与平原对照比较无显著差异；大鼠比目鱼肌中段MHC主要由Ⅰ(78％)、Ⅱa(22％)2种异构体组成，缺氧组比目鱼肌MHC由Ⅱa向Ⅰ型转变，单纯运动和缺氧复合运动组与缺氧组变化趋势相同，但缺氧复合运动组显著低于单纯运动组。结论: 慢性缺氧和运动训练后，大鼠比目鱼肌肌纤维MHC组成向能量利用效率更高的慢收缩肌纤维Ⅰ型转变，提示慢性缺氧和缺氧复合运动后比目鱼肌能量利用效率增加。     

心肌肌钙蛋白T的研究进展

肌钙蛋白复合体发现于1965年，当时认为它是一种球蛋白，分子量为50Kd。不久发现，肌钙蛋白复合体由三种蛋白质组成：TnT、TnL、TnC。每种蛋白质各具有重要的生物学特性，其中TnT的作用是将肌钙蛋白附着在原肌球蛋白上，是重要调节蛋白。就心肌来说，大量文献证明，cTnT（心肌肌钙蛋白）为心肌损伤的特异性、敏感性指标。现就cTnT研究进展综述如下.[第一段]     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力.方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank's液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次.合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108 L-1密度接种,常规培养3 d后更换培养基,待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107 L-1密度传代.③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达.结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19.②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白.③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达.结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞.     

自发性高血压鼠心脏组织肌球蛋白轻链磷酸酶水平的研究

目的:比较自发性高血压大鼠(SHR)和正常血压大鼠(WKY)心脏组织的心肌肌球蛋白磷酸酶(MLCP)的130000、38000、21000亚单位含量的差异,以探讨MLCP与SHR心脏舒缩机制的关系。方法:在4℃的环境下,取SHR与WKY大鼠各10只断头处死,迅速取其心脏组织,称重速冻后将其磨成匀浆,置于缓冲液中并通过离心提取蛋白质,校正2组总蛋白的浓度后,分别应用SDS-PAGE、Western印迹杂交和化学发光的方法测定SHR与WKY心脏组织MLCP的130000、38000、21000亚单位的含量,对显影结果进一步进行吸光度扫描分析。结果:SHR和WKY大鼠心脏组织的MLCP的亚单位的含量不同,SHR的MLCP的130000、38000、21000亚单位含量均高于WKY大鼠(P<0.01)。结论:SHR与WKY大鼠心脏组织MLCP的130000、38000、21000亚单位含量有着明显的差异,提示心脏组织的MLCP结构或功能的异常可能与SHR高血压的病理机制有关。     

环孢素A对DSS结肠炎小鼠肠黏膜通透性影响及其机制的研究

目的探讨环孢素A(CsA)对葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及作用机制。方法 C57BL/6J小鼠(6～8周龄、体质量20 g±2 g、♂),实验分为正常对照组(饮用无菌蒸馏水+腹腔注射0.9%NS)、DSS模型组(DSS溶液+腹腔注射0.9%NS)、环孢素A组(DSS溶液+腹腔注射CsA)。小鼠自由饮用5%DSS溶液1周制备结肠炎模型,环孢素A(0.025 mg.g-1)腹腔注射给药,每天1次,共7 d。每日行DAI评分,实验结束后取结肠进行HE染色评分,结肠匀浆检测MPO活性、TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平,另取小鼠小肠黏膜进行透射电镜检查和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)活性测定,采用Evans blue和异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-D)方法检测小肠黏膜通透性。结果与正常对照组比较,模型对照组小鼠1周后出现明显体重减轻、便血和腹泻,DAI评分和HI评分增高,同时结肠黏膜MPO活性明显增高。电镜检查小鼠回肠黏膜上皮绒毛萎缩、排列不规则,细胞间连接复合体缩短、变宽,细胞间隙扩大,小肠黏膜通透性增高。小鼠结肠匀浆中TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平均有不同程度增高,小肠黏膜中MLCK活性明显增高。与DSS模型组比较,环孢素A组小鼠DAI评分和HI评分明显降低,结肠黏膜MPO活性减低,回肠黏膜上皮细胞绒毛排列整齐,小肠黏膜通透性降低,小肠黏膜MLCK活性和结肠匀浆中TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平均有不同程度降低。结论环孢素A具有明显的抗DSS小鼠结肠炎作用,机制可能与通过调控MLCK表达,改善肠黏膜通透性有关。     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ研究进展

非肌肉细胞中存在的肌球蛋白Ⅱ称为非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ),与肌肉中肌球蛋白Ⅱ具有类似的化学结构,其活性受自身轻链和重链磷酸化水平调节。除了作为一种分子马达为细胞内各种分子运动提供动力外,NMⅡ还参与细胞迁移、黏附、胞质分裂等各种生理活动。     

替米沙坦对肾性高血压大鼠心肌β-肌球蛋白重链表达的影响

目的观察替米沙坦对肾性高血压大鼠心肌β-肌球蛋白重链(β-MHC)的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分为假手术组、模型组和替米沙坦组,每组10只。模型组及替米沙坦组采用两肾一夹法,制备肾血管性高血压模型,替米沙坦组用替米沙坦(10 mg.kg-1.d-1)灌胃干预。术后8周,经动脉插管测血压,经超声心动图评估心脏结构及功能,HE染色观察心肌病理改变;RT-PCR法检测心肌β-MHC mRNA水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠血压显著升高,心肌肥厚(均P<0.01),细胞直径增大,排列不整齐。与模型组相比,替米沙坦组大鼠血压明显下降,心肌无明显肥厚(均P<0.01),其心肌β-MHC mRNA表达水平较模型组明显降低(P<0.05)。结论替米沙坦可下调肥厚心肌β-MHC基因表达水平,可能与其逆转心肌肥厚相关。     

实验性自身免疫性肌炎动物模型的制作

目的探讨实验性自身免疫性肌炎(EAM)动物模型制作方法。方法实验动物选用健康雌性英国短毛豚鼠20只,分为正常组5只、佐剂对照组5只、EAM组10只。正常组不予任何处理;佐剂对照组采用完全弗氏佐剂(CFA)0.25mL加等量PBS;EAM组采用CFA 0.25mL加等体积浓度为10mg/L的兔纯化肌球蛋白悬液,分别于0、7、14、21d进行分次皮下注射,并在0、7d同时联合腹腔注射百日咳杆菌原液。评价实验动物的临床症状、血肌酶及病理改变。结果正常组及佐剂对照组动物的临床症状、血肌酶及病理改变未见异常。EAM组动物血肌酶升高,临床症状与病理改变与人类多发性肌炎类似,模型成功率为80%。结论应用纯化肌球蛋白制作实验性自身免疫性肌炎动物模型死亡率低,成功率高,为研究人类发性炎性肌病发病机理和治疗提供较好的工具,肌球蛋白可能是诱发自身免疫反应的候选成分之一。     

家族性肥厚型心肌病大家系肌球蛋白结合蛋白C3基因突变筛查

目的 研究一汉族家族性肥厚型心肌病(FHCM)家系患者的致病基因突变位点,分析其基因型与表型关系.方法 收集到一规模较大的FHCM家系,共5代89位成员,采集到67份血样.用primerexperss 2.0软件设计引物扩增肌球蛋白结合蛋白C3( MyBPC3)基因的各外显子及相邻内含子区,产物纯化后应用美国ABI PRISM 3700 DNA自动测序仪进行测序,用Autoassembler 2.0软件将测序结果与MyBPC3的基因组序列进行比较、分析.结果 该家系共14例患者(4例已去世,其中2例是年轻时猝死),在世的10例患者左心室壁厚度均超过13 mm.符合常染色体显性遗传病的特点.经突变筛查,发现2处碱基改变,经检索国家生物技术信息中心单核苷酸多态性数据库,这些碱基改变均为多态性.结论 MyBPC3基因不是该家系的致病基因,反映了肥厚型心肌病的遗传异质性,需对其他可能的候选致病基因进行筛查.