用Percoll连续密度梯度离心及阿新蓝-吉氏染色分离和鉴定隐孢子虫卵囊

Carcia等(1983)报道检测隐孢子虫卵囊最有效的浓缩方法是Sheather’s溶液漂浮法,且若用相差显微镜观察制备的标本无需染色。随后相继发展了一些净化隐孢子虫卵囊的技术。迄今,应用最广泛的较新方法有Percoll不连续密度梯度分离法和使用由Zierdt(1984)发明的寄生虫浓缩装置。但由于在卵囊悬液中含有大量的污染物,使用这些方法不能获得良好的效果。作者在寻找分离卵囊的新方法时发现,用ConcanavalinA-Sepharose 4B代价昂贵,而用Percoll连续密度梯度离心分离则较快速,并且能回收原样本中80％的卵囊。至今在试验过的所有染色方法中,对粪便样本中诊断最有效的方     

人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集

为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC)的标化流程,采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用羟乙基淀粉(6%HES)法从中分离出单个核细胞(MNC),再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+3个细胞亚群,用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。结果表明:机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30±3.51)×108,与脐血初始样品所含的MNC数(8.86±5.38)×108比较差异无统计学意义,而其CD34+细胞所占百分率[(3.93±2.31)%]则明显高于脐血[(0.44±0.29)%]。胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC和CD34+细胞的回收率分别为(45.3±11.7)%和(51.1±9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后,其CD34+细胞的纯度和回收率分别为(73.4±14.1)%和(52.7±11.7)%。结论:本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC,为进一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集方案。     

人羊膜间充质细胞具有分化成软骨及成骨细胞的潜能

目的:人羊膜间充质细胞具有比骨髓间充质干细胞更强的扩增能力和免疫原性低等优势。建立体外适宜的诱导培养条件,观察人羊膜间充质细胞定向分化为软骨细胞和成骨细胞的能力。方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。①材料来源:经产妇知情同意,无菌采集健康足月分娩新生儿胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:采用机械法剥离羊膜组织,二步酶消化法分离收获人羊膜间充质细胞,按2.2×10~8L~(-1)密度接种,传至第1～2代用于诱导分化实验。向软骨细胞诱导分化时,人羊膜间充质细胞按3×10~8L~(-1)密度接种,诱导培养液为含体积分数0.01的胎牛血清、10 mg/L转化生长因β1、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、1%培养基添加物。向成骨细胞诱导分化时,人羊膜间充质细胞按6×10~7L~(-1)密度接种,诱导培养液为含体积分数0.1的胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、5 mmol/Lβ-甘油磷酸。③实验评估:原代细胞用流式细胞仪分析表型,免疫细胞化学染色进行波形蛋白表达鉴定。分别于体外诱导第7,14,21,28天采用免疫细胞化学法检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达,细胞化学法检测蛋白聚糖的表达,钙-钴法检测成骨细胞特异性碱性磷酸酶的表达,茜素红S检测钙盐沉积情况。结果:①免疫组化与表型特征:人羊膜间充质细胞高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD44和间充质细胞标志波形蛋白。②向软骨细胞诱导分化:诱导14 d后,人羊膜间充质细胞由长梭型逐渐变为多角形,可检测到Ⅱ型胶原蛋白表达及软骨细胞特异性细胞外基质蛋白聚糖。③向成骨细胞诱导分化:诱导21 d后,可观察到人羊膜间充质细胞的胞浆内有碱性磷酸酶表达,且可见钙盐沉积。结论:人羊膜间充质细胞具有分化成软骨细胞和成骨细胞的特性,可作为骨及软骨组织工程种子细胞的新来源。     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力.方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank's液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次.合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108 L-1密度接种,常规培养3 d后更换培养基,待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107 L-1密度传代.③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达.结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19.②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白.③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达.结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞.     

人胎盘组织来源造血干/祖细胞及其特性

背景:近年来的研究表明,除已知的人骨髓、外周血和脐带血中存在造血干/祖细胞外,人胎盘组织中也有造血干/祖细胞存在.目前为止,还缺乏对人胎盘组织造血干/祖细胞的增殖分化特性及人胎盘组织淋巴细胞亚群组成和免疫原性等的深入研究.目的:探究人胎盘组织是否含有比脐带血更丰富的造血干/祖细胞,并对其造血祖细胞系增殖分化能力进行检测,同时对人胎盘组织淋巴细胞亚群组成及表型特征进行分析.设计、时间及地点:开放性实验,于2004-01/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集遵义医学院附属医院产科健康足月分娩新生儿胎盘和脐带血共12份.淋巴细胞亚群检测试剂盒,CD34绝对计数试剂盒(Becton Dickinson公司):CD34磁珠分选试剂盒,FITC标记的CD38单克隆抗体,抗FITC磁珠和MS/LS免疫磁式细胞分选柱(Miltenyi Biotec).方法:脐带血与RPMI-1640培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)按1:1的比例混合,采用Ficoll-Histopaque分离液离心30min,吸取界面层细胞,PBS洗涤一次,获得脐带血单个核细胞.采用机械法加0.25g/L胶原酶消化制备胎盘组织单个细胞悬液,之后同脐带血单个核细胞分离步骤分离胎盘单个核细胞.流式细胞仪检测胎盘单个核细胞中CD34 CD38-, CD34 CD38 造血干/祖细胞(HSPCs)和淋巴细胞亚群的组成比例.免疫磁珠分选法分选人胎盘CD34 CD38-,CD34 D38 造血干/祖细胞,并分别进行粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位系集落形成培养,以评价其造血祖细胞系增殖分化能力.实验全程用脐带血作平行比较分析.主要观察指标:胎盘和脐带血CD34 造血干/祖细胞组成百分率、祖细胞系集落形成能力、淋巴细胞亚群表型及组成特点.结果:[1]胎盘CD34 造血干/祖细胞百分率是脐带血的8.8倍,差异有显著性意义(P<0.01).[2]胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞(CD3 CD2 )、B细胞(CD19 )、Th(CD3 CD4 )细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血,而CD8 CD28-T抑制细胞则明显高于脐带血,差异有显著性意义(P<0.01).[3]胎盘CD34 CD38 造血干/祖细胞亚群培养形成的粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位集落数明显高于CD34 CD38-造血干/祖细胞亚群(P<0.01);胎盘与脐带血造血干/祖细胞中相同表型细胞亚群形成的各系集落数比较,差异无显著性意义(P0.05).结论:人胎盘组织富含CD34 造血干/祖细胞,其CD34 CD38 、CD34 CD38-两个造血干/祖细胞亚群均具有增殖分化为粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位的能力,并且人胎盘组织具有淋巴细胞亚群低比例和抑制性T细胞高比例的特点,使其有望成为造血干/祖细胞移植的新来源.     

快速检测结核杆菌DNA电化学传感技术的研究

目的 构建DNA电化学传感器用于快速检测结核杆菌的新方法.方法 根据互补序列一段设计捕获探针,另一段设计信号探针,两段探针与互补链结合构建“三明治”电化学传感模式,结合酶的催化作用放大电化学信号,实现对靶序列的高灵敏检测.结果 在优化条件下目标链浓度(10 nmol/L)检测结果的相对标准偏差(RSD)=5.0％(n=5);目标DNA在浓度为50 ～ 200 pmol/L范围内与电流值呈线性相关,回归方程:电流(I) =720.4 +93.6×浓度(c),r=0.9982,检出限为1.6×10-12 mol/L.结论 此方法构建的传感器具有较高的检测灵敏度与良好的特异性.     

肠线虫感染病原检查优化方案的研究

目的　探究肠线虫感染人群病原检查优化方案。方法　比较分析定量透明法、饱和盐水浮聚法和钩蚴试管滤纸培养法对不同感染率、感染度肠线虫卵检出效果。应用指数曲线拟合法分析定量透明法的检漏规律。结果　定量透明法检查蛔、钩、鞭虫卵存在检漏 ,且检查钩、鞭虫卵的检漏率 (EPG <2 5时 ,检漏率分别达 80 8%和 64 5 % )与感染度成反比。结论　在低感染度人群普查或防治效果考核中应选用定量透明法并用饱和盐水浮聚法     

重组杜氏利什曼原虫39kD抗原的诊断价值

为了给内脏利什曼病（ＶＬ）患者提供较为准确的实验诊断方法。我们将表达杜氏利什曼原虫３９ｋＤ抗原的大肠杆菌制备物进行电泳并转移至硝酸纤维滤膜上，以１１例确诊ＶＬ病人的不同稀释度血清对其识别，当稀释度达１∶４００时，全部病人血清均能明显识别３９ｋＤ抗原带．而正常人血清和其他病人血清不识别３９ｋＤ抗原带，说明重组杜氏利什曼原虫３９ｋＤ抗原具有一定的诊断价值，用其检测病人血清中相应抗体可以诊断内脏利什曼病。     

大鼠肱二、肱三头肌肌纤维型组成及分布研究

采用Guth—Samaha肌球蛋白ATP酶组织化学染色法并稍做改良，分别对成年SD大鼠肱二、肱三头肌长头冰冻切片进行肌纤维染色分型研究。发现大鼠肱二、肱三头肌长头均可分出两型肌纤维，即Ⅰ型纤维（慢缩纤维）和Ⅱ型纤维（快缩纤维），并且两型肌纤维在两肌中均呈棋盘样均匀分布；图像分析仪计数肱二头肌长头以Ⅱ型纤维占绝对优势，肱三头肌长头则以Ⅰ型纤维为主。提示大鼠肱二头肌为力量兼速度型肌，而肱三头肌则为耐力型肌，主要参与维持肢体姿势。     

无机骨材料对上颌窦提升术后骨再生的影响

目的：研究兔上颌窦提升术后扩增区域内新生骨的改建过程和破骨细胞的分布情况,探讨无机骨颗粒对上颌窦提升术后骨再生的影响。方法：对8只日本大耳白兔施行上颌窦提升术。实验组扩增区植入无机骨颗粒,对照组仅使血凝块充满扩增区,不填充移植材料。结果：术后4周,对照组扩增区近窦黏膜处的新生骨表面可见大量破骨细胞。组织形态测量学分析表明,术后4周至8周实验组窦底提升高度显著大于对照组;术后8周时实验组新生骨面积较对照组明显增加。结论：上颌窦内存在的空气压力可导致上颌窦提升术后新生骨发生吸收。在上颌窦提升术中使用无机骨填充材料可抵抗上颌窦内的空气压力,并具有良好的骨重建效果。