人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)bFGF表达的影响.方法 密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人源性bFGF基因转染至第2代MSCs,在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态和生长的变化,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法鉴定bFGF在MSCs中的表达.结果 密度梯度离心、贴壁法培养分离可获得MSCs,P3代大鼠细胞利用流式细胞仪检测CD11b/c阳性细胞表达率为(13.2±0.6)%,CD34阳性细胞表达率为(1.2±0.5)%,CD44阳性细胞表达率(97.8±0.9)%,CD90阳性细胞表达率(96.8±1.4)%.MSCs转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.RT-PCR证实转基因MSCs表达bFGF mRNA明显增强,Western blot检测证实转基因MSCs在49 KDr出现特异性条带,而空白和空载组的MSCs则未见阳性条带.结论 采用慢病毒介导的基因转染技术可以将bFGF基因转染至MSCs中,并有外源性bFGFmRNA和蛋白的有效表达,MSCs可作为bFGF基因治疗的载体.     

过表达CCAAT增强子结合蛋白α对HepG2细胞代谢能力的影响

HepG2细胞系具有较强的稳定性、增殖力、并且能分泌多种血浆蛋白等优点,而它的某些合成代谢功能远不能满足生物人工肝的要求.     

CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA.方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达.结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达.结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞药物转化功能的测定

目的了解转染SV40基因对正常成人肝细胞药物转化功能的影响。方法高效液相色谱法检测肝细胞对利多卡因的转化能力;Western blotting法检测两种肝细胞内细胞色素P450的表达。结果转染前、后肝细胞中利多卡因的浓度两者的利多卡因转化率无明显差异;两组肝细胞在蛋白电泳后都出现了54kU的蛋白条带,表明两种细胞均能表达细胞色素P450,均具有P4502E的免疫反应性。结论转染永生化基因前后的正常成人肝细胞均具有药物代谢所必需的细胞色素P450酶蛋白,仍保持了正常成人肝细胞的代谢功能。     

转染CD147干扰质粒肝癌细胞7721的鉴定

目的构建CD147干扰质粒,对肝癌细胞7721内源性CD147表达的抑制效果进行检测。方法设计及构建3对pGenesil-1-CD147/shRNA及1对阴性对照干扰质粒,通过测序鉴定。将干扰质粒用Lipofec-tamineTM2000转染肝癌细胞,通过瞬时转染获得细胞系,实时PCR和蛋白印迹法检测3对干扰质粒、阴性对照质粒的mRNA及蛋白表达水平。结果实时PCR和蛋白印迹法结果显示干扰质粒pGenesil-1-CD147/shRNA3对肝癌细胞7721内CD147mRNA及蛋白的抑制效果最显著。结论成功构建了CD147干扰真核表达载体,筛选出有效干扰质粒,为进一步研究低表达CD147的肝癌细胞7721在肝癌发生发展中的机制提供基础。     

泊洛沙姆407修饰对聚乙烯亚胺的毒性和转染性质的影响

目的:考察泊洛沙姆407修饰对聚乙烯亚胺(PEI)的毒性和转染性质的影响.方法:使用琥珀酰亚胺碳酸脂法将P407连接在PEI的氨基上,得到新聚合物,通过1H-NMR确定新聚合物的结构,将该聚合物与DNA形成复合物,测定复合物的zeta电位,MTT法考察复合物的细胞毒性,使用质粒pGL3-lus作为报告基因,测定虫荧光素酶活性评价复合物对Hela细胞的转染效率.结果:1H-NMR结果表明合成的聚合物具有较高的纯度.复合物的Zeta电位随氮/磷比(N/P)值的增加而增高.复合物的细胞毒性随着N/P值的增加而增大,新聚合物其细胞毒性显著低于未修饰的PEI.新聚合物在高N/P值时仍能保持较高的转染效率.结论:泊洛沙姆407修饰的PEI可以作为一种有效的非病毒基因栽体.     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

Development of a cell sorting procedure to increase the sensitivity of detection of protein-protein interactions in plant protoplasts

To visualize subcellular localization of viral proteins and interactions between viral proteins and host proteins in vivo, transfection of plasmids into protoplasts to over-express transiently fusion proteins with a fluorescent tag is a common method. However, due to the low efficiency (0.1-3.0%) of plasmid transfection into protoplasts, it is difficult to identify protoplasts that emit fluorescence using confocal microscopy. A flow cytometry sorting protocol was developed for separating kenaf protoplasts that emit yellow fluorescence. The sorted protoplasts showed strong fluorescence and the protoplasts were intact. This will improve the use of confocal microscopy for studying subcellular localization and protein interactions in protoplasts isolated from plants with low transfection efficiency.     

Amphiphilic and biodegradable hy-PEI-g-PCL-b-PEG copolymers efficiently mediate transgene expression depending on their graft density

Novel biodegradable amphiphilic copolymers hy-PEI-g-PCL-b-PEG were prepared by grafting PCL-b-PEG chains onto hyper-branched poly(ethylene imine) as non-viral gene delivery vectors. Our investigations focused on the influence of graft densities of PCL-b-PEG chains on physico-chemical properties, DNA complexation and transfection efficiency. We found that the transfection efficiencies of these polymers increased at first towards an optimal graft density (n=3) and then decreased. The buffer-capacity-test showed almost exactly the same tendency as transfection efficiency. Cytotoxicity (MTT-assay) depended on the cooperation of PEG molecular weight and graft density of PCL-b-PEG chains. With increasing the graft density, cytotoxicity, zeta-potential, affinity with DNA, stability of the polyplexes and CMC-values were reduced strongly and regularly. Increasing the excess of polymer over DNA was shown to result in a decrease of the observed particle size to 100-200 nm.