六味地黄丸增效小鼠黑色素瘤HSV-tk/GCV 自杀基因疗法的免疫机制

目的明确六味地黄丸是否增强单纯疱疹病毒核苷激酶/更昔洛韦（HSV-tk/GCV）自杀基因疗法对小鼠黑 色素瘤的免疫杀伤效果,并对其相关机制进行探索。方法采用Western Blot 实验、免疫荧光实验检测六味地 黄丸对缝隙连接蛋白43（Cx43）表达水平及膜定位的影响;通过荧光黄染料、钙黄绿素荧光传输实验检测六味 地黄丸对小鼠黑色素瘤细胞B16（B16 细胞）缝隙连接通讯（GJIC）功能的影响;PI/Hoechst 染色实验检测CD8+ T 细胞对B16 细胞的免疫杀伤效果;CD8+ T 细胞激活实验观察GJIC 在六味地黄丸增强对小鼠黑色素瘤免疫杀 伤中的作用。结果自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗较单独应用自杀基因疗法能更显著地抑制肿瘤生长; Western Blot 及免疫荧光实验显示六味地黄丸组Cx43 表达明显上调,荧光传输实验显示六味地黄丸组B16 细 胞GJIC 功能显著增强;PI/Hoechst 染色实验显示,六味地黄丸组CD8+ T 细胞对B16 细胞的免疫杀伤效果更加 显著,阻断Cx43 后,对B16 细胞的免疫杀伤效果则被逆转,同时CD8+ T 细胞的激活也被减弱。结论六味 地黄丸可通过上调B16 细胞中Cx43 的表达,改善GJIC 功能,促进肿瘤抗原的交叉提呈,更强地激活CD8+ T 细 胞以增强其对肿瘤细胞的免疫杀伤效果。     

痰瘀互结证局部脑缺血再灌注动物模型的实验研究

目的 利用高脂喂养结合大脑中动脉栓塞法建立痰瘀互结证局部脑缺血再灌注动物模型,以验证该造模方法的可行性。方法 将35只雄性SD大鼠按随机数字表法分为普通喂养组15只和高脂喂养组20只,分别予以普通饲料和高脂饲料喂养4周。再将大鼠重新编号,普通喂养组随机分为正常组10只和普通模型组5只,高脂喂养组随机分为假手术组10只和高脂模型组10只,其中两个模型组采用大脑中动脉栓塞法复制脑缺血再灌注模型。造模完成24 h后进行Zea Longa评分以评价其神经功能缺损程度;继续喂养1周后,采血检测血脂四项（TC、TG、LDL-C、HDL-C）及凝血功能（APTT、PT、FIB）水平,取脑计算脑系数及制作脑组织病理切片,以评价模型的建立和病理生理特点。结果 经过4周的喂养,与普通喂养组比较,高脂饲料喂养组大鼠日平均饮食量及饮水量均明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。喂养10天、20天后,高脂喂养组大鼠体重低于普通喂养组（P<0.05）,喂养4周后,两组体重比较差异无统计学意义 （P>0.05）。完成造模后,模型组左侧肢体偏瘫,右侧面瘫症状明显,行走呈逆时针追尾状,甚或往健侧倾倒,精神萎靡,活动减少,身体蜷缩,舌质紫暗。与正常组、普通模型组比较,高脂模型组TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均显著升高（P<0.05）;与正常组比较,两模型组APTT、PT值显著降低（P<0.05）,高脂模型组脑系数值升高（P<0.05）;与假手术组比较,高脂模型组PT值降低（P<0.05）、脑系数升高（P<0.05）。两模型组间APTT、PT、FIB及Zea Longa评分比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 高脂饲料喂养结合大脑中动脉栓塞法在SD大鼠体内可以成功建立病证结合的痰瘀互结证局部脑缺血再灌注模型。     

国医大师禤国维教授治疗顽固性脂溢性脱发1例

正脂溢性脱发是青春期后头额、颞、顶部进展缓慢的脱发,是皮肤科常见的难治性疾病之一。临床上患者往往伴有头部皮脂溢出较多、头皮屑多、瘙痒等症状。好发于20～40岁男性,早期表现两侧鬓角至前额发际处不同程度脱发,甚至形成"高额",前发际线呈M型,随病情发展,头顶部头发成弥漫性脱落,晚期发展至仅枕部及两侧颞部保留少许头发,脱落区皮肤光滑无萎缩,可伴有油腻、瘙痒、脱屑等症状。本病病因不明,西医认为多与遗传、雄性激素水平上升、局部炎症反应等有关[1]     

基于病毒-宿主交互网络的加味芦根方治疗流行性感冒的生物信息学分析

目的 从病毒-宿主交互界面探讨加味芦根方（芦根、全蝉蜕、僵蚕、金银花、生甘草、薄荷、羌活、葛根、柴胡）治疗流行性感冒的分子机制。方法 从本草组鉴数据库收集复方的化学成分,经里宾斯基五原则筛选潜在的活性成分后,进一步在瑞士靶点预测网站预测活性成分的作用靶点;从GEO数据库挖掘人类流感芯片GSE90732的差异表达基因;从病毒-宿主相互作用搜索工具检索H1N1流感-智人蛋白交互组;整合上述生物信息集,通过Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用网络和加味芦根方-病毒-宿主交互网络,使用R软件对交集基因进行功能富集分析,最后对关键活性成分及靶点进行分子对接验证。结果 获得1 252个活性成分,1 415个作用靶点,951个流感差异表达基因和10 142对H1N1-智人蛋白互作信息。加味芦根方与流感的交集靶点有72个,功能富集显示这些靶点与宿主防御和程序性细胞死亡密切相关。交互网络拓扑分析表明,加味芦根方通过齐墩果酸、γ-十一碳酸内酯、长棘素等多种活性成分调控病毒M2、NA、NS1和HA蛋白和/或宿主HSP90AA1、NRAS和ITGB1等多个关键靶标发挥治疗作用,分子对接结果表明活性成分...     

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的 探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法 制备六味地黄丸含药血清（分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清）及10.0%对照血清。 采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白（Cx）26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26－309、Cx26－337、Cx26－367、Cx26－2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26－2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能（gap junctional intercellular communication, GJIC）抑制剂甘草次酸（GA）对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组（简称低、中、高剂量组）及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20 mol/L,GA终浓度为50 mol/L。结果 六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43 mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率（48.75%、59.39%、69.28%）与阻断后细胞抑制率（29.14%、38.71%、58.13%）比较,显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。     

基于“气化则湿亦化”论治湿滞三焦

：“气化则湿亦化”论述源于清代医家吴鞠通的《温病条辨》。三焦之湿均因气化不利所致,治湿皆需以行气为本,重 在宣畅气机,恢复三焦气化。治湿犯上焦,需宣肺利气、化湿开郁;治湿阻中焦,重在健脾行气,使脾气畅达,既助湿 化,又杜生湿之源;治湿滞下焦,需淡渗通阳,因势利导。治湿之“开上、宣中、导下”三法均寓有“气化湿亦化”之机 理,而轻宣、开泄、芳化、淡渗等诸法也应随证而用。“气化则湿亦化”学术思想的挖掘可为中医湿证的基础研究与治湿法 的临证应用提供理论参考。     

基于网络药理学的淫羊藿苷对氟尿嘧啶所致大鼠骨髓间充质干细胞凋亡抑制作用的机制研究

目的基于网络药理学的淫羊藿苷（ICA）对氟尿嘧啶（5-FU）所致大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡抑 制作用机制研究。方法在TCMSP 数据库收集淫羊藿苷的药代动力学相关数据，利用CTD 和GeneCards 两个 数据库，检索获取淫羊藿苷的所有潜在作用靶点，采用DAVID 6.8 数据库对淫羊藿苷潜在靶点进行GO 富集 分析以及进一步的筛选收集关键靶点。将关键靶点导入STRING 数据库，结合运用Cytoscape 3.8.2 软件制作蛋 白互作网络（PPI），并用STRING 数据库进行通路富集分析（KEGG）。采用Western Blot 法检测Akt/GSK3β/ CyclinD1 通路3 个特征蛋白以及凋亡密切相关蛋白Bcl-2、Bax 的表达情况。结果获得淫羊藿苷潜在作用靶 点83 个，进一步筛选得到关键靶点29 个，通路富集分析结果按照FDR 值从小到大排序，其前20 条中具有重 要作用的为PI3K-Akt 通路、HIF-1 信号通路以及FoxO 信号通路等。基于KEGG 富集分析结果，建立了 PI3K-Akt 核心作用通路的可视化通路网络图。Western Blot 实验结果揭示，与模型组比较，淫羊藿苷处理组 p-Akt（P＜0.01）的表达升高，p-GSK3β 水平和CyclinD1 的表达有升高趋势（P＞0.05），Bcl-2/Bax 比值升高 （P＜0.001）；LY294002 抑制Akt 磷酸化之后，相应p-Akt、p-GSK3β 水平和CyclinD1 的表达下降（P＜0.05， P＜0.001），Bcl-2/Bax 比值减少（P＜0.001）。结论淫羊藿苷对5-FU 所致大鼠骨髓间充质干细胞凋亡抑制作 用可能是通过激活Akt/GSK3β/CyclinD1 信号通路以及Bcl-2 途径介导的。     

过表达及定点突变缝隙连接蛋白Cx43小鼠黑色素瘤细胞模型的构建

目的 构建小鼠黑色素瘤细胞（B16）过表达野生型及点突变型缝隙连接蛋白43（Connexin43,Cx43）细胞模型,为以缝隙连接（Gap Junction,GJ）为靶点的中药复方、中药单药及药物单体的研究提供可靠阳性对照和阴性对照。方法 构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒,用定点突变技术获得Cx43G21R和Cx43G138R突变体,对上述3种质粒进行双酶切和测序鉴定,并分别包装病毒感染B16细胞,使B16细胞过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R。Western blot检测Cx43蛋白表达水平变化,荧光示踪法观察缝隙连接通讯（Gap Junction Intercellular Communication,GJIC）功能变化。结果 ①酶切及测序证明,成功构建pLVCx43-mCherry、pLVCx43-mCherryG21R、pLVCx43- mCherryG138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒。②成功感染B16细胞并筛选稳定过表达Cx43、Cx43G21R、Cx43G138R细胞株,Western blot检测显示上述细胞株Cx43蛋白表达均高于对照组。③过表达野生型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组增强;过表达突变型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组减弱。结论 过表达野生型Cx43可增强B16细胞GJIC功能,过表达突变型Cx43可抑制B16细胞GJIC功能。     

基于脑脊液蛋白组学探讨二仙汤抗抑郁作用

目的?探讨二仙汤对抑郁大鼠模型的干预作用及可能机制。方法?将体重和糖水偏爱度合格的Wistar大鼠（45只）平均分为3组：正常组、模型组、二仙汤组，每组15只。通过慢性温和不可预计应激（CUMS）造模6周制备抑郁模型，其中正常组和模型组给予生理盐水灌胃，二仙汤组给予二仙汤灌胃。6周后进行大鼠行为学测试；运用免疫荧光方法观察各组大鼠海马DG区NeuN神经元数目及BrdU/DCX阳性细胞数；运用串联质谱标签法（TMT）蛋白质组学分析各组大鼠脑脊液（CSF）差异蛋白的表达谱；通过Gene Ontology （GO）注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）通路富集分析二仙汤抗抑郁的相关通路和蛋白；通过平行反应监测（PRM）验证差异蛋白中与细胞增殖分化相关的蛋白。结果?造模6周后，行为学结果显示，与正常组比较，模型组大鼠体重、糖水偏爱度、矿场活动总路程降低，强迫游泳不动时间延长（P=0.000）；与模型组比较，二仙汤组大鼠体重、糖水偏爱度、矿场活动总路程升高，强迫游泳不动时间缩短（P=0.000）；免疫荧光结果显示，与正常组比较，模型组大鼠海马DG区神经元数目减少及神经干细胞增殖分化减弱（P=0.000）；与模型组比较，二仙汤组海马DG区的神经元数目增多、神经干细胞增殖分化增强（P=0.000）。TMT蛋白组学筛选到由模型组和二仙汤组共同调节的差异蛋白共40个，PRM结果显示，Rps19、Rps4x、Rps12、Rps14、Vim、UBA1在CUMS造模后上调，而二仙汤治疗后下调。结论?二仙汤具有良好的抗抑郁及抗海马损伤效应。其可能通过调控CSF中与核糖体、泛素介导的蛋白水解作用通路相关的蛋白如Rps19、Rps12、Rps14、Vim、UBA1，来缓解海马神经元损伤，改善抑郁症状。