E型沙眼衣原体持续性感染模型的建立与鉴定

目的构建E型沙眼衣原体(Ct)持续性感染细胞模型,为深入研究Ct致病机制提供实验基础。方法用不同剂量人重组干扰素-γ(IFN-γ)处理Ct感染的HeLa细胞,体外诱导Ct持续性感染,间接免疫荧光法检测不同剂量IFN-γ下Ct包涵体形态的变化;移除处理因素,继续培养16 h后观察Ct包涵体形态,并计算Ct包涵体形成单位(IFUs)。实时定量PCR检测Ct DNA修复和重组(dnaA和dnaK)、细菌分裂(ftsK)、蛋白水解和肽转运(oppA.4和htrA)、膜结构(ompA)、发育调节(htcA)和分子伴侣(groEL)等相关基因转录水平。流式细胞术和Hoechst染色检测持续性感染12 h、24 h、40 h时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导后的HeLa细胞凋亡率。结果75 U/mL IFN-γ可显著降低Ct感染能力,包涵体形态亦发生明显改变;移除IFN-γ后Ct IFUs为(12.60±0.52)×10⁹/L,而未移除IFN-γ组IFUs为(3.60±0.52)×10⁹/L,Ct感染力得到显著提高(P＜0.05)。持续性感染组dnaA、dnaK、groEL、ompA、ftsK和htcA基因转录水平在不同的感染时间发生不同程度的改变;而oppA.4和htrA在急性和持续性感染状态下转录水平差异无显著性(P＞0.05)。凋亡诱导后,与HeLa细胞凋亡率33.63%比较,流式细胞检测Ct持续性感染12 h、24 h、40 h时细胞凋亡率分别为14.77%(P＜0.05)、18.71%(P＜0.05)、26.32%(P＞0.05);Ct在感染12 h和24 h时呈现抗凋亡效应,随着感染时间延长,衣原体抗凋亡能力下降。结论成功构建IFN-γ诱导的E型Ct持续性感染体外模型,持续性感染状态的Ct能抑制细胞凋亡。     

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白激活p38MAPK和NALP3信号通路调控THP-1细胞IL-1β分泌的研究

目的研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5质粒蛋白诱导THP-1细胞产生IL-1β的分子机制,为阐明Ct致病机制提供实验依据。方法将原核表达重组体pGEX-6p/pORF5转化大肠埃希菌,表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切后制备不含GST标签的pORF5蛋白;用不同浓度的pORF5蛋白体外刺激THP-1细胞,ELISA测定不同时间IL-1β水平;分别用NALP3siRNA、ASC siRNA、Caspase-1抑制剂和p38抑制剂预处理THP-1细胞,再用pORF5蛋白刺激THP-1细胞24h,ELISA测定IL-1β含量,Real-time PCR测定IL-1β和NALP3炎性体mRNA的表达,Western blot分析Caspase-1的表达及p38磷酸化水平。结果 pORF5蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激THP-1细胞产生IL-1β,24μg/ml pORF5蛋白刺激24h时IL-1β的表达水平达到峰值(495.1±55.5pg/ml);pORF5蛋白能促进THP-1细胞中NALP3炎性体mRNA的表达;NALP3-siRNA、ASC-siRNA及Caspase-1抑制剂预处理THP-1细胞后,IL-1β分泌量分别降低37.7%、71.3%和40.1%;p38抑制剂能降低NALP3炎性体mRNA及IL-1β分泌量(P0.01),但抑制NALP3炎性体后p38磷酸化水平未受影响(P0.05)。结论 pORF5质粒蛋白通过激活p38MAPK和NALP3信号通路共同调控IL-1β的产生和分泌。     

运用Quantity One 软件分析日本血吸虫不同发育时期蛋白组分差异

目的应用Quantity One软件进行图像分析,阐明日本血吸虫不同发育时期蛋白组分的差异。方法以日本血吸虫尾蚴人工感染昆明鼠,分别收集感染前和感染后第8、12、16、20、24天和第28天虫体,用SDS-PAGE平行分离各时点虫体蛋白,用图像分析软件Quantity One4.4比较分析其区带差异。结果图像分析软件Quantity One4.4分析7个不同时点的虫体蛋白区带显示:区带数在0、8、12、16、20、24d和28d虫体中分别为27、30、33、32、31、36条和29条,各时点虫体特异性区带在0、8、12～24d和28d虫体中分别为7、4、8、3条,虫体特异性区带多为低表达量的条带。结论运用图像分析软件能够快速获得日本血吸虫不同发育时期蛋白泳道条带的分析图形,自动计算出蛋白区带数、区带光密度值大小和分子量。     

连续传代对鼠衣原体生长相关性状及其毒力影响的初步研究

目的探讨体外特殊条件下鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)连续传代培养后在感染性、生长发育以及致病性等生物学性状上的变化,为筛选减毒活疫苗,筛查毒力相关基因提供依据。方法将实验室Cm野生株(G0)通过常规细胞培养,在辅助或不辅助培养条件下交替连续传代后,将亲本株G0与获得的传代株G28进行衣原体感染离心依赖性、细胞吸附能力、衣原体感染细胞生长曲线、衣原体形成的噬斑大小以及两种菌株在感染小鼠生殖道后所形成的输卵管病变情况进行检测。结果与亲本株G0相比,传代株G28对感染离心条件的依赖性显著下降(P<0.05);对感染细胞的吸附能力却明显上升(P<0.05);G0与G28在感染细胞32 h内的生长曲线差异并无统计学意义;在感染细胞中所形成的噬斑大小也无明显区别;但体内毒力试验中,G0感染小鼠后致输卵管病变率为87.5%,而G28的输卵管病变率仅为37.5%,两者形成差异有统计学意义。结论Cm传代株G28与亲本株G0相比,在感染能力显著增强的情况下,其致病性却显著降低,为后续鉴定毒力基因,进一步提取基因型单一的减毒株并应用于衣原体减毒活疫苗带来了希望。     

粤北地区铜绿假单胞菌的临床分布和耐药性特点

目的分析粤北地区临床分离的铜绿假单胞菌株分布特点和对常用抗菌药物的耐药特点,为临床合理选用抗菌药物治疗、预防感染及防止耐药菌株的产生提供参考依据。方法按常规方法从粤北地区临床标本中分离培养铜绿假单胞菌,应用WHONET5.6和SPSS19.0统计软件分析2013-2014年的药敏试验数据,分析铜绿假单胞菌的耐药特点。结果 584株铜绿假单胞菌感染主要来自于重症医学科、骨科和呼吸内科,以呼吸道标本和伤口分泌物标本为主;铜绿假单胞菌对药敏试验的12种抗菌药物具有不同程度的耐药性,其中耐药率最高的是庆大霉素,对喹诺酮类、碳青霉烯类、加酶抑制剂类耐药率相对较低,头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星和头孢哌酮/舒巴坦的耐药性呈下降趋势。结论铜绿假单胞菌主要引起肺部和伤口感染,尤其在重症医学科、骨科和呼吸内科的老年患者多见;该菌对临床常用抗菌药物的耐药率相对较低,但临床仍需规范使用抗菌药物,以减少耐药菌株、尤其是多重耐药株和泛耐药株的产生。     

肺炎支原体P1蛋白的研究进展

支原体是一类可在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物,肺炎支原体作为常见的人类病原体,主要通过黏附呼吸道上皮细胞表面并释放多种有害物质破坏黏膜上皮从而引起肺炎等多种呼吸道感染性疾病。肺炎支原体的致病性与其黏附能力密切相关,实现细胞黏附的蛋白位于一个尖端结构——黏附细胞器上,其中包含1 627个氨基酸的P1蛋白作为主要黏附蛋白引起人们的关注。其强抗原性也为支原体肺炎的诊断和防治提供了方向。因此,对肺炎支原体P1蛋白的研究,有助于了解其致病机制,并做出针对性诊断、治疗和预防措施。     

日本血吸虫组织蛋白酶B2在小鼠抗血吸虫再感染中的作用

目的 构建日本血吸虫组织蛋白酶B（Sjcb2）真核表达载体,检测日本血吸虫组织蛋白酶B2单独和联合吡喹酮（PZQ）在小鼠抗血吸虫再感染中的作用.方法 将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型：感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组、Sjcb2联合吡喹酮处理组.Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1（＋）/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1（＋）空质粒.初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗.除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染.分别于第8周和第14周取各组小鼠肝脏组织做病理切片,观察虫卵肉芽肿大小;采用间接ELISA法检测血清中特异性IgE和IgG亚型（IgG1,IgG2和IgG3）;检测各组小鼠荷成虫数,计算抗血吸虫再感染率.结果 Sjcb2免疫组、联合组与其它组分别比较,小鼠荷虫数显著性减少,抗血吸虫再感染率显著升高,虫卵肉芽肿直径显著减小,IgG1水平显著下降和IgE水平显著升高（P〈0.01）.结论 Sjcb2在小鼠模型中具有抗日本血吸虫再感染作用,抗血吸虫再感染率为70.3%,抗再感染作用机制可能与特异性IgE水平升高和IgG1水平下降有关.     

穿透支原体脂质相关膜蛋白诱导人单核细胞产生炎症性细胞因子

穿透支原体（M.penetrans，Mpe）是从感染人类免疫缺陷病毒的患者球液中分离出来的，被称为艾滋病相关支原体。Mpe能依靠其特殊的顶端结构黏附和入侵宿主的红细胞、CD4^＋T细胞和巨噬细胞等，但关于其对宿主的致病性及其可能的致病机制还不十分清楚。脂质相关膜蛋白（LAMPs）是暴露在Mpe表面与周围环境各种成分不断相互作用因而影响机体的免疫系统的一种主要蛋白。我们的研究证实，Mpe LAMPs能诱导小鼠巨噬细胞表达诱导性一氧化氮合酶和产生一氧化氮。     

健身操运动对女大学生血清总补体活性的影响

目的 观察有氧健身操运动对女大学生血清中总补体活性的影响，为开展健身操运动提供实验依据。方法 从南华大学护理学院2003级学生中随机抽取30名女生分成3组，即对照组、实验1组与实验2组，后两组每周分别进行1次与3次有氧健身操运动，共12周。利用50％溶血法于0、2、4,6、8、10、12周测定机体血清总补体活性。结果 每周锻炼3次者，血清总补体活性出现先降低后增强的变化趋势。在第8周补体活性回复到运动前水平，第10周、12周活性增强，并维持较高水平。结论 坚持运动量适中的有氧运动，能增强血清总补体的活性，提高抗病能力。     

沙眼衣原体T3SS效应蛋白CT622的表达与多克隆抗体制备以及对HeLa细胞增殖的影响北大核心CSCD

目的原核表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)CT622蛋白,制备CT622多克隆抗体,初步探讨CT622蛋白对HeLa细胞增殖的影响,为进一步阐明CT622蛋白在沙眼衣原体致病中的作用提供实验依据。方法以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载体pGEX-6p-1/CT622;重组载体经IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST-CT622融合蛋白,PreScission Protease酶切除GST标签后获取纯化的CT622蛋白;将纯化的CT622蛋白去内毒素处理后,经皮下免疫新西兰兔获取抗CT622抗体,采用抗原亲和纯化层析柱进行抗体纯化,BCA测定抗体浓度,SDS-PAGE鉴定多克隆抗体纯度,ELISA检测抗体效价;用不同浓度的CT622蛋白处理HeLa细胞24 h,CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞存活率(%)。结果成功表达并纯化了CT622蛋白,该蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度0.8 mol/L,30℃、180 r/min条件下诱导4 h。制备兔源性抗CT622多克隆抗体,纯化后抗CT622抗体浓度为0.75 mg/ml,纯度>70%,ELISA检测免疫兔血清抗体效价为1∶512000左右;经1~15μg/ml浓度梯度的CT622蛋白处理HeLa细胞后,其细胞存活率高于对照组。结论成功表达、纯化了沙眼衣原体CT622蛋白,制备了高效价兔源性抗CT622抗体。在一定浓度范围内,CT622蛋白能促进HeLa细胞的增殖。