表达在HEK293细胞上的BKCa通道基本特性与动力学调控研究

目的构建稳定表达人血管平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)的293细胞系,并研究其基本电生理学特征和动力学模型。方法通过脂质体(lipofectamine 2000)转染法转染BKCa表达质粒pcDNA3.1-BKα和(或)pIRES-BKβ1,筛选稳定表达的单克隆细胞系。使用膜片钳多种记录方式研究其基本电生理学特性,同时建立BKCa动力学研究模型。结果构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系,通过膜片钳能够记录到具有与天然细胞BKCa电生理学特性相似的电流,包括大电导特性[内面向外式构型下单通道电导为(216.38±3.55)pS]、电压依赖性、Ca2+依赖性、钾离子选择性和200nmol/L IbTX(BKCa特异性阻断剂)阻断;联合表达β1亚单位能够明显增加通道的开放时程。采用inside-out宏观电流记录方式可以记录到明显的尾电流。可以用于分析通道激活、去激活等动力学模型及药物动力学作用机制。结论成功构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系。膜片钳实验证明具有典型的BKCa电生理学特性,同时建立的细胞系可以很好的用于BKCa通道功能调控研究和动力学参数分析。     

组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9对myogenin基因表达的影响

目的利用本组构建的小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9真核表达质粒及RNA干扰(siRNA)质粒,在体外成肌细胞分化模型C2C12细胞中检测SET7/9对肌肉分化关键基因myogenin基因表达的影响。方法转染SET7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-SET7/9至C2C12细胞,Western blot技术验证其表达;利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测SET7/9对myogenin基因mRNA水平的影响;利用双荧光素酶报告系统检测SET7/9对myogenin基因启动子活性的影响;转染SET7/9的siRNA质粒,利用Real-time PCR技术检测其抑制效果以及对myogenin mRNA水平的影响。结果 SET7/9真核表达质粒pCMV-3tag-6-SET7/9可在C2C12细胞中有效表达;SET7/9可使myogenin mRNA水平升高并能够促进myogenin启动子活性升高;干扰SET7/9表达可使myogenin mRNA水平降低。结论组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET7/9可激活肌肉分化关键基因myogenin的转录。     

超顺磁性三氧化二铁纳米粒子对小鼠活动日节律的影响

目的研究进入脑室的超顺磁性铁纳米粒子(SPION)是否对小鼠活动的昼夜节律有影响。方法选6周龄的C57BL/6J小鼠,人工光照环境光照∶黑暗=12∶12(光照:8:00~20:00;黑暗:20:00~次日8:00)。自由摄食饮水。待动物完全适应新环境(约2周)后,将动物转入全黑暗环境继续饲养14天,然后开始转轮实验。选择CT(circadian time)14时间点,侧脑室注射三氧化二铁纳米粒子(SPION)4μl;对照组侧脑室注射不含SPION的溶剂(超纯水)4μl。注射后继续转轮实验若干时间。分别在侧脑室注射10min、24h、14天和30天后处死动物,并取脑组织做石蜡切片,经普鲁士蓝染色观察SPION在脑室内的分布情况。用VitalView动物行为节律记录仪连续监测小鼠转轮运动节律的变化情况。用real time-RT-qPCR检测钟基因的变化。结果侧脑室注射SPION10min和24h后,SPION仅分布于脑室壁上,神经细胞内未见染色。注射SPION 14天、尤其是30天后可见脑内神经细胞有SPION染色。同时,侧脑室注射SPION可引起中枢钟视交叉上核(SCN)的periods钟基因转录上调,小鼠转轮运动日节律向后漂移。结论 SPION经侧脑室注射后可进入脑细胞内,影响了SCN钟基因的表达以及运动日节律的改变,提示进入脑内的纳米材料可影响生物节律。     

应用改良体细胞基因敲入技术内源标记跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1的研究

目的应用改良的体细胞基因敲入技术将标签序列靶向敲入目的基因。方法设计引物并构建RHBDD1的打靶载体,经过腺相关病毒包装、感染、新霉素筛选和鉴定等步骤获得含有新霉素抗性的阳性单克隆细胞株,最后通过cre病毒感染和筛选获得RHBDD1内源敲入FLAG和SBP双标签的HCT116结直肠癌细胞株。结果经过包装病毒感染与筛选验证后得到6个打靶阳性克隆;进一步经cre病毒感染与筛选后得到2株去除新霉素抗性标记的阳性细胞克隆;通过Western blotting实验证明RHBDD1-FLAG-SBP融合蛋白的表达。结论通过改良的体细胞基因敲入技术成功构建跨膜丝氨酸蛋白酶RHBDD1内源敲入FLAG和SBP双标签的HCT116结直肠癌细胞株。     

2020–2030年中国4种主要癌症相关死亡率的预测

背景与目的 癌症已成为全球性健康问题,评价癌症死亡率对公共健康政策制定和资源合理分配具有重要价值.本研究旨在预测中国4种常见癌症(肺癌、肝癌、胃癌和食管癌)2020–2030年的死亡率和死亡人数,估算因人口老龄化和吸烟引起的癌症负担.方法 癌症死亡数据(2004–2017年)来源于中国死亡监测数据集,中国人口数据(20...     

TrkA与snapin蛋白的直接相互作用

目的确认TrkA与snapin蛋白间的直接相互作用。方法采用DNA重组技术,构建增强型荧光蛋白表达载体pECFP-TrkAICD(TrkA膜内区)和pEYFP-snapin,共转染HEK 293T细胞后以激光扫描共聚焦显微镜观察并进行荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)分析。结果成功构建了snapin和TrkA的重组质粒,共转染细胞后激光扫描共聚焦显微镜分析表明两种蛋白分布在细胞质同一层面,荧光共振能量转移(FRET)分析表明能量转移效率>5%,与对照相比有显著区别(P<0.05)。结论激光扫描共聚焦及FRET实验结果都证明了TrkA膜内区与snapin两个蛋白之间存在着直接的相互作用。     

染色质体外组装相关蛋白的表达纯化及组装体系的建立

目的提取并纯化真核细胞核内组蛋白,表达并纯化重组组蛋白、染色质组装相关因子NAP-1(nuclear assemblyprotein-1)及ACF(ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor),并建立无细胞体外染色质组装体系。方法在大肠杆菌BL21中表达并应用离子交换层析纯化组蛋白,从真核细胞HeLa细胞核中提取并应用羟基磷灰石纯化组蛋白八聚体,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf9中表达并纯化组装相关因子,应用纯化得到的蛋白在适宜条件下进行染色质体外组装,并用微球菌核酸酶酶切检测。结果获得了高纯度的原核表达的组蛋白,真核细胞组蛋白八聚体及组蛋白特异伴侣NAP-1和ACF;建立了由质粒DNA、纯化的真核细胞核内重组组蛋白、重组NAP-1、重组ACF及ATP为核心成分的体外染色质组装的无细胞系统,经微球菌核酸酶检测组装成功。结论利用体外分离纯化的多种重组蛋白,可成功构建基因的染色质模板,为在体外染色质模板上进行基因转录的调控机制研究奠定了基础。     

人结直肠癌细胞Drosha基因敲除细胞模型的构建

目的 为研究核酸酶Drosha与结直肠癌的关系,利用腺相关病毒（AAV）介导的染色体同源重组技术,构建Drosha基因敲除的HCT116结直肠癌细胞模型.方法 设计引物通过PCR扩增Drosha基因的同源臂,构建Drosha的AAV病毒打靶载体,通过病毒的包装、感染、抗生素新霉素（G418）药物筛选、PCR以及Western blot鉴定获得基因敲除阳性细胞株,通过Cre病毒感染去除抗性基因,最终建立敲除Drosha基因的结直肠癌细胞模型.结果 经过两轮打靶,分别将DNA双链上的Drosha基因去除并经Western blot鉴定,获得Drosha-/-阳性的HCT116细胞株.结论 通过AAV病毒介导的染色体同源重组技术,成功构建Drosha基因敲除的HCT116细胞系.     

HSD1与微管蛋白在生精细胞中的定位关系研究

目的 确定HSD1与微管蛋白在生精细胞中的定位关系,为进一步研究其在精子发生中的功能奠定基础.方法 通过分子克隆方法构建GFP-HSD1和FLAG-HSD1的真核表达质粒,转染精母细胞系GC-2spd (ts),同时筛选稳定表达FLAG-HSD1的细胞株.应用免疫荧光实验观察外源和内源表达的HSD1与微管蛋白α-tubulin在GC-2spd(ts)或小鼠原代生精细胞中的定位分布.结果 成功构建稳定表达FLAG-HSD1融合蛋白的GC-2spd(ts)细胞株.外源表达HSD1在GC-2 spd(ts)中与α-tubulin明显共定位;内源表达HSD1与α-tubulin在GC-2spd(is)和原代小鼠生精细胞中明显共定位.结论 HSD1与微管蛋白α-tubulin在生精细胞中存在明显的共定位关系.     

中美医学院校药理学教学的比较与启示

本文从课程设置、教学方法、教学手段以及考核方式等方面对中国（大陆地区）和美国两国医学院校的药理学教学进行比较,并从两国药理学教学的差异中借鉴一些能够提高我国药理学教学质量的经验,以期为我国药理学教学的改革提供新的思路.