睾丸高表达蛋白质HSD-14对小鼠精子发生的影响

目的 研究睾丸高表达基因HSD-14及其编码蛋白质对小鼠精子发生的影响.方法 利用本实验室构建的人睾丸特异ESTs文库,通过电子克隆方法获得一新基因命名为HSD-14基因.纯化原核表达的HSD-14蛋白,并制备兔多克隆抗体.通过HE染色观察腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后小鼠睾丸组织的生精变化,并进行TUNEL凋亡检测.结果 电子克隆获得HSD-14基因,在原核表达系统中表达成功.小鼠腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后,均发现曲细精管中生精细胞大量脱落,生精细胞的层次紊乱,管腔内有时可见成团脱落的生精细胞,附睾中几乎观察不到成熟精子.TUNEL凋亡检测结果表明,抗体注射组小鼠曲细精管中生精细胞(以精母细胞为主)凋亡程度较正常小鼠睾丸和免疫前血清注射组明显,且多数细胞停留在精母细胞甚至精原细胞的阶段.结论 HSD-14通过诱导精母细胞凋亡抑制小鼠精子发生.     

精子膜蛋白的研究Ⅱ.具有同种抗原性的兔精子膜蛋白A的免疫活性及理化性质

本文研究了兔精子膜蛋白A的免疫功能.发现其抗体在体外具有凝集精子的作用,如将此蛋白注入雄兔体内,可影响其精子的生成.作者还报告了兔精子膜蛋白A的分子量、等电点、N-末端及氨基酸组成等理化性质。     

应用酵母双杂交法对人精子膜蛋白YWK-Ⅱ胞外区作用配体的筛选

ＹＷＫⅡ蛋白质是本实验室发现的一种具有单一跨膜结构的精子膜蛋白,由胞外区、疏水的穿膜区和胞内区组成。其ｃＤＮＡ序列全长３６５７ｂｐ,命名为ＨＳＤ２,开放阅读框（ＯＲＦ）长２２８９ｂｐ,编码７６３个氨基酸。实验证明,胞外区部分结构具有较强的抗生育作用,而胞内段能在细胞水平上与Ｇｏ蛋白特异结合。为了寻找ＹＷＫⅡ蛋白质可能的作用配体,本实验系用酵母双杂交系统对睾丸文库进行筛选。将ＹＷＫⅡ蛋白质胞外段近膜区２２６个氨基酸与转录因子Ｇａ１４的ＤＮＡ结合域（ＢｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎ,ＢＤ）构成融合…     

睾丸表达新基因HSD-28的克隆及其编码蛋白质的研究

目的 研究从人初级精母细胞特异EST文库中克降的新基因HSD-28及编码蛋白质在精子发生过程中的表达及可能发挥的功能.方法 利用根据本实验室构建的人初级精母细胞特异EST文库,通过电子克隆方法,从网络数据库资源获取基因HSD-28.纯化原核表达系统表达的HSD-28蛋白,以此免疫新西兰白兔制备针对HSD-28的特异性多克隆抗体.采用免疫组化的方法研究HSD-28在人睾丸组织中的表达定位.最后,利用酵母舣杂交系统筛选与HSD-28相互作用的蛋白质.结果 克隆得到了的HSD-28基因,提交GenBank获得登陆号为AY251533,全长为641个碱基,其中开放阅读框为504碱基,编码一个由168个氨基酸构成的蛋白质,命名为HSD-28蛋白.将构建的pET-30a-HSD-28重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌,表达并纯化了HSD-28蛋白,大小约为28kDa.免疫组织化学结果显示,HSD-28蛋白特异的定位于人精原细胞和早期初级精母细胞.筛选得到与HSD-28相互作用的两个阳性克隆45#和106#.结论 从人睾丸cDNA文库中成功克隆得到HSD-28基因,其编码蛋白质表达定位于人精原细胞和初级精母细胞中,可能参与精子发生过程中减数分裂的调节.     

不同晶胶比液体早期复苏对重症急性胰腺炎患者预后的影响

目的对不同晶胶比液体早期复苏对重症急性胰腺炎患者预后的影响进行观察。方法回顾性分析宁波市鄞州区第二医院重症科2006年2月～2013年4月接诊的48例SAP患者的临床资料,以第一个24h液体品胶比1．5和3为界,将患者随机分为三组。分别为A组（晶胶比〈1．5）、B组（晶胶比1．5～3）和C组（品胶比〉3）,观察三组的应用效果。结果A组第一个24h机械通气率和IAP以及液体潴留量均明显高于B组和C组,且氧合指数明显低于B组和C组。A组患者的输注晶体液量显著大于B组和C组。A组患者的2周内存活率显著低于B组和C组。结论SAP患者早期采用适当晶胶比的控制液体复苏,能显著影响患者治愈。     

人结直肠癌细胞Drosha基因敲除细胞模型的构建

目的 为研究核酸酶Drosha与结直肠癌的关系,利用腺相关病毒（AAV）介导的染色体同源重组技术,构建Drosha基因敲除的HCT116结直肠癌细胞模型.方法 设计引物通过PCR扩增Drosha基因的同源臂,构建Drosha的AAV病毒打靶载体,通过病毒的包装、感染、抗生素新霉素（G418）药物筛选、PCR以及Western blot鉴定获得基因敲除阳性细胞株,通过Cre病毒感染去除抗性基因,最终建立敲除Drosha基因的结直肠癌细胞模型.结果 经过两轮打靶,分别将DNA双链上的Drosha基因去除并经Western blot鉴定,获得Drosha-/-阳性的HCT116细胞株.结论 通过AAV病毒介导的染色体同源重组技术,成功构建Drosha基因敲除的HCT116细胞系.     

HSD1与微管蛋白在生精细胞中的定位关系研究

目的 确定HSD1与微管蛋白在生精细胞中的定位关系,为进一步研究其在精子发生中的功能奠定基础.方法 通过分子克隆方法构建GFP-HSD1和FLAG-HSD1的真核表达质粒,转染精母细胞系GC-2spd (ts),同时筛选稳定表达FLAG-HSD1的细胞株.应用免疫荧光实验观察外源和内源表达的HSD1与微管蛋白α-tubulin在GC-2spd(ts)或小鼠原代生精细胞中的定位分布.结果 成功构建稳定表达FLAG-HSD1融合蛋白的GC-2spd(ts)细胞株.外源表达HSD1在GC-2 spd(ts)中与α-tubulin明显共定位;内源表达HSD1与α-tubulin在GC-2spd(is)和原代小鼠生精细胞中明显共定位.结论 HSD1与微管蛋白α-tubulin在生精细胞中存在明显的共定位关系.     

一氧化氮对重症急性胰腺炎肺损伤的作用及其机制

目的研究一氧化氮(NO)减轻重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤的机制。方法采用逆行胰胆管牛磺胆酸钠注射制造SAP大鼠模型。动物分为假手术组、胰腺炎组、L-精氨酸(L-Arg)治疗组和氯喹(CQ)治疗组。硝酸还原酶法检测肺组织NO的浓度变化,实时定量PCR(RT-PCR)检测肺组织TLR(Toll-like receptor)2／4 mRNA表达变化。结果与假手术组比较,SAP大鼠肺组织NO浓度降低,肺损伤加重;肺组织TLR2／4 mRNA表达增高,肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达升高(P<0．05)。给予不同剂量L-Arg治疗后,肺组织NO浓度明显升高,肺损伤程度减轻;TLR2／4 mRNA表达降低,肺组织TNF-α表达降低(P<0．05)。给予CQ抑制肺组织TLR2／4 mRNA表达后,肺组织内NO浓度升高,肺损伤减轻,TNF-α表达降低(P<0．05)。结论NO可以明显抑制SAP肺组织TLR2／4 mRNA的表达,减少细胞因子的合成及释放,从而减轻肺组织损伤。     

精子膜蛋白的研究——Ⅲ、兔精子膜蛋白“A”的定位及其酯酶活性的观察

利用异硫氰荧光素-蛋白A的免疫荧光抗体技术,确定了兔精子膜蛋白“A”的定位,证明它是结合精子膜表面上的一种蛋白质。此外,应用苯甲酰L-精氨酸乙酯盐酸盐及兔IgG为底物,证明所提取的精子膜蛋白“A”不具有酯酶活性。     

利塞膦酸钠对绝经后骨质疏松患者外周血单核细胞的影响

目的观察利塞膦酸钠对绝经后骨质疏松症患者外周血单核细胞(PMBC)分泌肿瘤坏死因子(TNFα),白细胞介素1(IL1),白细胞介素6(IL6)水平及PBMC细胞数目的影响。方法采用双盲法将54名绝经后骨质疏松妇女随机分为治疗组和对照组,所有患者在用药前和用药后6月进行外周血单核细胞(PBMC)培养,并以放射免疫方法(RIA)检测培养上清中TNFα、IL1、IL6水平,计录PBMC细胞数目改变。结果利塞膦酸钠治疗组服药6月后,PBMC培养上清中TNFα、IL1水平较治疗前有所下降,IL6较前增加,与对照组无统计学差异,PBMC细胞数目也无明显改变(P>0.05)。结论利塞膦酸钠作为一种骨吸收抑制剂,口服治疗对PBMC分泌细胞因子(IL1、IL6和TNFα)及细胞数目并无明显影响,这些结果提示利塞膦酸钠并未通过影响PBMC参与骨代谢调节。