尼莫地平对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑神经元的 保护作用及其机制

目的： 探讨尼莫地平对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑神经元的保护作用及其对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响并阐明其作用机制。方法：30只雄性Wistar大鼠随机分
为假手术组、模型组和尼莫地平组,每组10只。采用线栓法堵塞大鼠大脑中动脉制作脑缺血再灌注损伤模型。缺血2 h再灌注2 h后进行神经功能学评分。之后断头取脑,应用TUNEL染色及SP免疫组织化学方法观察脑组织梗死情况并检测Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。结果：与模型组比较,尼莫地平组大鼠脑组织凋亡细胞数明显减少(P<0.05),Bax蛋白表达水平减少(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平增加(P<0.05)。形态学观察,模型组大鼠脑细胞坏死严重,水肿明显;尼莫地平组大鼠脑组织坏死细胞数减少,水肿情况有所改善。结论：尼莫地平对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织具有保护作用,其作用可能是通过下调Bax和上调Bcl-2相关蛋白表达从而抑制
脑神经元凋亡实现的。     

邻苯二甲酸二乙基己基酯对胎鼠肺发育的抑制作用

目的探讨孕大鼠染毒邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对胎鼠肺发育的抑制作用及其可能机制。方法 Sprague-Dawley大鼠受孕后第12天每天ig给予DEHP0,10,100和750mg.kg-1,至自然分娩。第1天每窝随机取自然分娩仔鼠3只,测定体质量;光镜观察肺组织病理学改变及测定辐射状肺泡计数(RAC)和肺间质比例,免疫组化法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果与正常对照组相比,DEHP组仔鼠体质量明显下降(P<0.01)。光镜下仅DEHP750mg.kg-1组可见肺间质增厚,间质细胞增多,肺泡数目减少,RAC减小,肺间质比例增大(P<0.05)。与正常对照组比较,DEHP组VEGF表达差异无统计学意义;DEHP10,100和750mg.kg-1组MMP-2表达和MMP-2/TIMP-2值明显高于正常对照组〔MMP-2分别为0.099±0.009,0.124±0.008,0.140±0.010vs0.091±0.011(P<0.01);MMP-2/TIMP-2分别为1.079±0.074,1.447±0.077,1.704±0.084vs0.994±0.079(P<0.01)〕。结论孕鼠染毒DEHP后对胚胎生长和肺发育有抑制作用。DEHP抑制胎鼠肺发育的机制可能与MMP-2的过度表达以及MMP-2/TIMP-2平衡失调有关。     

配对盒基因2对正常肾小管上皮细胞间充质转分化的诱导作用

［摘 要］ 目的:观察体外转染配对盒基因2（PAX2）对肾小管上皮细胞表型标志物的影响,探讨PAX2诱导转分化的作用,为肾纤维化治疗提供依据。方法:正常肾小管上皮细胞株NRK52E分为对照组、空载组(转染pGC-Fu空质粒)和转染组(采用脂质体转染法将pGC-FU-GFP-PAX2质粒转染至细胞中)。转染72 h后应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态,应用Western blotting法和Real-time PCR法检测PAX2蛋白和mRNA表达水平;转染72 h后应用免疫组织化学法、Western blotting法和Real-time PCR法检测各组细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin) 和α-肌动蛋白(α-SMA)及其mRNA表达水平。结果：pGC-FU-GFP-PAX2转染72 h后,转染组细胞绿色荧光强度较对照组明显增强,且肾小管上皮细胞的形态伸长; Western blotting法检测,转染组PAX2蛋白表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;Real-time PCR检测,转染组细胞的PAX2mRNA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;转染组细胞中的E-cadherin染色较空载组和对照组明显减弱;α-SMA染色较空载组和对照组明显增强。Western blotting法检测,转染组细胞中E-cadherin表达水平明显低于空载组和对照组（P<0.05）;α-SMA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;Real-time PCR检测,转染组细胞中E-cadherin mRNA表达水平明显低于空载组和对照组（P<0.05）;α-SMA mRNA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）。结论：PAX2转染正常肾小管上皮细胞后E-cadherin表达减少,α-SMA表达增加,PAX2可能在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化。     

Correlative Analysis on the Relationship between PMI and DNA Degradation of Cell Nucleus in Human Different Tissues

Summary： To determining the postmortem interval （PMI） through quantitative analysis of the DNA degradation of cell nucleus in human brain and spleen by using image analysis technique （IAT）. The brain and spleen tissues from 32 cadavers with known PMI were collected, subjected to cell smear every 1 h within the first 5-36 h after death, stained by Feulgen-Van＇s staining, Three indices reflecting DNA in brain cells （astrocytes） and splenic lymphocytes, including integral optical density （IOD）, average optical density （AOD）, average gray （AG） were measured by employing the mage analysis instrument. The results showed that IOD and AOD declined and AG increased with the prolongation of dead time within 5 36 h. A correlation between the PMI and gray parameters （IOD,AOD and AG） was identified and the corresponding regression equation was obtained. The parameters （IOD, AOD and AG） were proved to be effective quantitative indicators for accurate estimation of PMI within 5-36 h after death.     

Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良

目的：通过改良细胞培养方案建立体外诱导Raw264.7 细胞分化形成成熟破骨细胞（OC）的高效培养体系。方法：向Raw264.7细胞培养液α-MEM中添加50 μg•L^-1 M-CSF、100 μg?L-1 RANKL和1×10^-8 mol•L^-1 1α,25-（OH）2D3， 于5% CO2 、 37℃孵箱中培养12 d，每3　d换液1次，每次换液前对细胞进行短暂消化。倒置显微镜下观察细胞形态变化，并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、FITC-phalloidin染色和免疫荧光染色鉴定OC是否成熟并具有吞噬功能。结果：通过改良培养方法，在诱导过程中培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色，诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%；FITC-phalloidin染色，伴随着OC成熟，伪足内出现的束状伪足小体逐渐变为环形，最终融合带状肌动蛋白环环绕在胞质周围；免疫荧光染色，诱导12 d后OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加，TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。提示获得的OC成熟并具有吞噬功能。结论： 本实验通过改良培养方法，联合应用细胞因子50 μg•L^-1 M-CSF、100 μg•L-1 RANKL和1×10^-8 mol•L^-1 1α,25-（OH）2D3建立了体外诱导Raw264.7 细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。     

半乳糖凝集素-3和细胞角蛋白19表达在甲状腺穿刺病理诊断中的应用

目的：观察半乳糖凝集素-3(Galectin-3)和细胞角蛋白19（CK19）在甲状腺穿刺标本中表达的特点,分析其在甲状腺良恶性病变鉴别诊断中的应用,探讨免疫组织化学方法标记CK19、Galectin-3表达在甲状腺穿刺小标本病理诊断中应用的可行性。方法：选择20例甲状腺乳头状癌（PTC）及16例甲状腺良性病变(BTL)穿刺组织,观察HE切片病理形态学特点,应用免疫组织化学EnVision法检测标本中Galectin-3、CK19和Ki67蛋白表达,对比3种蛋白在不同组间的表达,分析3种抗体在甲状腺术前穿刺病理诊断中的作用。结果：Galectin-3、CK19和Ki67在PTC组阳性率分别为90%（18/20）、95%（19/20）及60%（12/20）,在BTL组阳性率分别为12.5%（2/16,均为弱阳性）、31.25%（5/16,均为弱阳性）及62.5%（10/16）。Galectin-3 和CK19在PTC与BTL组间表达率比较差异有统计学意义（均P<0.01）,而Ki67在PTC与BTL组间表达率比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Galectin-3和CK19蛋白在PTC与BTL的表达存在显著差异,联合检测该2种蛋白在甲状腺乳头状癌穿刺标本的鉴别诊断中具有重要的应用价值,能有效提高甲状腺病变术前穿刺活检的确诊率。     

尼可地尔后处理对心肌缺血-再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

目的: 观察尼可地尔后处理对心肌缺血-再灌注损伤( MIRI)大鼠心肌的保护作用,并探讨其作用机制。方法: 26只SD大鼠随机分为对照组(8只)、盐酸异丙肾上腺素（ISO）组(8只)和尼可地尔后处理组(10只)。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水,ISO组大鼠腹腔注射ISO 5 mg/kg,每隔24 h重复注射1次,连续注射3 d;尼可地尔后处理组于注射ISO 1 h后尾静脉注射尼可地尔(1 mg/kg),每日1次,连续3 d。于第3次注射ISO后24h断尾取血后处死,检测各组大鼠血清中乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸激酸（CK）活性;常规HE染色观察各组大鼠肌组织形态学表现;免疫组织化学染色法检测Caspase-3蛋白的表达;TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况。结果：尼可地尔后处理组与对照组比较血清LDH和CK活性差异无统计学意义（P>0.05）,但2组均低于ISO组（P<0.05）。HE染色,ISO组大鼠局部心肌组织变性坏死,伴有炎细胞浸润;尼可地尔后处理组大鼠坏死心肌细胞明显减少,炎症反应轻微;对照组大鼠心肌无异常表现。免疫组织化学染色,ISO组大鼠大量心肌细胞胞浆表达Caspase-3,对照组和尼可地尔后处理组大鼠Caspase-3无表达。尼可地尔后处理组细胞凋亡指数（AI）较ISO 组明显降低（P<0.01）。结论：尼可地尔可减轻大鼠MIRI,其作用机制可能与抑制Caspase-3激活、减少细胞凋亡有关。     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。