广州管圆线虫对淡水螺感染性的实验研究

目的比较研究广州管圆线虫对褐云玛瑙螺、福寿螺、中国圆田螺三种食用淡水螺的感染性。方法在相同的条件下,用广州管圆线虫I期幼虫感染三种螺,2、4、8、12及24 h后,随机抽样各20只,分别饲养于置有滤水器、水温（24±1）℃的玻璃缸内,记录感染2周内各组螺死亡数。第15天开始解剖,记录螺软体重量和感染虫数。同时设不感染螺对照组。结果三种螺感染后均有死亡,第5天死亡数达高峰。三种螺的感染率和死亡率与螺的种类及感染时间均无相关性;虫负荷与密度,福寿螺感染8、12及24 h均显著高于感染2h（P均〈0.05）,褐云玛瑙螺,感染24 h的均显著高于感染2、4、8及12 h的（P均〈0.05）,中国圆田螺,感染2、4、8、12及24 h各组间差异均无统计学意义（P均〉0.005）。褐云玛瑙螺感染8、12及24 h的虫负荷均显著高于福寿螺和中国圆田螺（P均〈0.05）。结论褐云玛瑙螺、福寿螺对广州管圆线虫易感并有较高的相容性,其中褐云玛瑙螺的相容性较强。     

恶性疟BCG多价疫苗及DNA疫苗的实验研制

本项目在恶性疟疫苗候选分子裂殖子表面蛋白-2（MSA2）及环子孢子蛋白（CSP）的分子生物学特征和免疫原性研究的基础上,构建了CSP、MSA2之DNA疫苗,同时率先在国内外构建CSP、MSA2之重组BCG活疫苗,并对疫苗的免疫保护机制、免疫应答及疫苗     

内皮型一氧化氮合酶基因A-922G多态性与缺血性脑卒中易感性的关联研究

目的探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因5’侧翼区-922A/G多态性与缺血性脑卒中关系。方法采用1∶1配比病例-对照研究设计,选择深圳市两家综合性医院的309例缺血性脑卒中患者为病例组,同时选择年龄、性别匹配的309例健康者作为对照。采用TaqmanMGB探针荧光定量PCR技术检测-922A/G变异,同时按照流行病学方法设计调查表进行问卷调查。结果-922A/G变异基因型(AA、AG、GG)频率缺血性脑族中组分别为78.96%、17.80%和3.24%;对照组基因型分布频率分别为85.11%、13.59%和1.29%。病例组的G等位基因频率(12.14%)明显高于对照组(8.09%)(P=0.018);携带至少一个G等位基因的基因型个体患缺血性脑卒中的风险为AA基因型的1.523倍(95%CI:1.005~2.309);条件logistic回归分析显示,在调整吸烟、饮酒、腰臀比、体重指数和高血压病史等因素的影响后,A-922G变异对缺血性脑卒中仍具有影响,OR为2.156,95%CI:1.081~4.299。结论eNOS基因-922A/G多表性可能与缺血性脑卒中的易感性有关联。     

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL—12P35 cDNA序列，并进行序列测定。方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL—12P35 cDNA序列，插入T载体PMD—T中，重组质粒转化大肠杆菌JM109，所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序。结果 从健康人外周血总DNA中扩增出约670bp条带，与预期大小相同，PCR与酶切鉴定证明得到PMD／P35阳性克隆，DNA测序证实了插入片段的正确性。结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL—12P35 cDNA序列。为继续开展IL—12的基础与应用研究奠定了基础。     

实时RT-PCR基因表达相对定量REST(C)软件分析与2(-△△CT)法比较

目的 利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法.方法 以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线.以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR.以GAPDH基因作为内参照.进行POLK基因表达相对定量.实验数据分别采用2(-△△CT)法及REST(C)软件分析.结果 5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq 0.997).POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%.采用2(-△△CT)法计算出的表达比值均比REST(C)软件分析高.结论 实时RT-PCR技术结合REST(C)软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段.     

广州管圆线虫对淡水螺感染性的实验研究

目的比较研究广州管圆线虫对褐云玛瑙螺、福寿螺、中国圆田螺三种食用淡水螺的感染性。方法在相同的条件下,用广州管圆线虫I期幼虫感染三种螺,2、4、8、12及24 h后,随机抽样各20只,分别饲养于置有滤水器、水温(24±1)℃的玻璃缸内,记录感染2周内各组螺死亡数。第15天开始解剖,记录螺软体重量和感染虫数。同时设不感染螺对照组。结果三种螺感染后均有死亡,第5天死亡数达高峰。三种螺的感染率和死亡率与螺的种类及感染时间均无相关性;虫负荷与密度,福寿螺感染8、12及24 h均显著高于感染2h(P均<0.05),褐云玛瑙螺,感染24 h的均显著高于感染2、4、8及12 h的(P均<0.05),中国圆田螺,感染2、4、8、12及24 h各组间差异均无统计学意义(P均>0.005)。褐云玛瑙螺感染8、12及24 h的虫负荷均显著高于福寿螺和中国圆田螺(P均<0.05)。结论褐云玛瑙螺、福寿螺对广州管圆线虫易感并有较高的相容性,其中褐云玛瑙螺的相容性较强。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

日本血吸虫Calpain的DNA疫苗诱导小鼠免疫保护性研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株Calpain的DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护性作用。方法　大量制备pVAC质粒DNA和pVAC -CalpainDNA疫苗 ,Balb/c小鼠 5 0只 ,随机均分为对照组和实验组 ,对照组每只小鼠的股四头肌注射接种 10 μgpVAC质粒DNA ,实验组以同样方式注射 10 μgpVAC -CalpainDNA疫苗 ,第 3周加强免疫一次。第 4周每只小鼠经腹部皮肤感染 ( 2 5± 1)条尾蚴 ,感染 6周后剖杀 ,从门静脉灌流收集计成虫数、碎脾计T淋巴细胞总数、从各鼠肝脏的同一部位切下小块肝组织 ,置 5 %KOH溶液消化后 ,计算每克肝组织虫卵数 ,比较减虫率、减雌率和减卵率。于免疫前、第一次免疫后 2周和感染后 2周分别从尾静脉采血 ,用ELISA测定抗体水平。结果　与对照组相比 ,实验组获得 36.84%的减虫率、36.36%的减雌率和 43.31%的减卵率 ,感染后实验组小鼠IgG抗体水平升高幅度大于对照组 ,对照组T淋巴细胞数显著多于实验组。结论　CalpainDNA疫苗可诱导小鼠产生较好的免疫保护作用 ,具有较大的发展潜力     

金葡菌野生株肠毒素B基因克隆及分子特征

目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素B（SEB）基因，并分析其分子特征。方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素B基因设计1对引物，采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因，将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB，并转化E．coli DH5 α；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法作序列测定分析，并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEB蛋白的二级结构。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段，所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致；测序结果表明，克隆的SEB基因含705个碱基，与S6株序列相比无碱基的插入或缺失，同源性为98．4％；存在11个碱基变异，其中7个为无义突变，4个为有义突变（突变位点位于第364，699．899．988位，编码氨基酸变化分别为：Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu）；所预测的2菌株SEB蛋白的二级结掏基本相同。结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEB基因，其在不同菌株间相对保守；由SEB基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEB生物活性与毒力的影响有待进一步研究。