阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

重组Calpain蛋白的免疫原性及其诊断上的应用研究

目的研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫诊断上的应用. 方法用重组Calpain蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)产生特征;同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原,粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗,肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清. 结果重组Calpain抗原免疫小鼠后,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体,免疫4周后IgG类抗体达到高峰,与对照组鼠相比较,免疫鼠血清中IgG1, IgG2a, IgG2b特异性抗体也有显著性的上升; Calpain重组抗原血清诊断日本血吸虫和粪检的符合率为100%, 粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高, EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低, 与肝吸虫的交叉反应率为37%. 结论日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白,能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白,能够敏感地测定日本血吸虫的感染, 说明Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子.     

甲硝唑诱导阴道毛滴虫凋亡样细胞死亡

目的凋亡或程序性细胞死亡在多细胞生物体中已经被广泛研究,然而,关于单细胞寄生性原生动物细胞凋亡发生的分子机制却知之甚少。本研究旨在了解甲硝唑诱导阴道毛滴虫细胞凋亡的特征。方法培养阴道毛滴虫并用不同浓度的甲硝唑进行处理。在不同的时间间隔进行活细胞计数。提取甲硝唑处理过的阴道毛滴虫基因组进行DNA断裂片段检测。用DNA断端末端标记(TUNEL)法测定甲硝唑处理后阴道毛滴虫核酸内切酶活性。流式细胞检测分析脂酰丝氨酸暴露情况。结果甲硝唑可以诱导阴道毛滴虫出现凋亡样细胞死亡。这种凋亡样细胞死亡表现为细胞皱缩,磷脂酰丝氨酸暴露以及核染色体凝聚,但并未检测到寡核苷酸DNA梯带。结论阴道毛滴虫程序性细胞死亡的调节通路不同于多细胞生物体。确定导致原生动物细胞死亡的凋亡通路也许最终可用于鉴定新的治疗靶点。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain-like基因片段,构建原核表达载体,诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫RH株Calpain-like基因片段,插入pGEM-T载体,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,亚克隆到原核表达质粒pET32a,重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段;含pET32a/Calpain-like的重组质粒在宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain-like基因,弓形虫Calpain-like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

感染洞庭湖外睾吸虫后钉螺产卵量及酶组织化学变化

本文从钉螺的产卵量、组织化学和超微病理学的角度阐述洞庭湖别、睾吸虫对其中间宿主-钉螺的影响。1材料和方法1．1钉螺来源来自湖南省华容县幸福牧场，均为bes旋成螺，长0．7-1．2cm，用单试管逸蚴法分离出外睾吸虫阳性钉螺（以下简称阳性钉螺），在显微镜下鉴别外睾吸虫尾坳。1．2钉螺分组及处理①将田注螺和阴性螺各月对，每对雌、雄各一只，分别饲养在60个不同的饲养钵内，钵内盛有经消毒后的泥土，并将泥土压紧提供钉螺的产卵条件，在3－6月份每10天在钵内取约0．3加表层泥皮，将取出的土样在60铜筛中筛洗，将筛中的沉渣在解剖镜下检查…     

日本血吸虫疫苗候选分子Calpain的原位表达

目的　探讨日本血吸虫疫苗候选分子———钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)在日本血吸虫体内的表达部位及其特征。方法　用重组纯化的Calpain抗原免疫大鼠 ,制备抗Calpain血清 ,从感染鼠灌流分离的日本血吸虫成虫被切片 ,用羊抗大鼠IgG抗体作为二抗进行免疫组织化学分析 ,观察Calpain蛋白在日本血吸虫成虫体内的表达部位。 结果　重组Calpain抗原免疫大鼠后 ,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体 ,并在日本血吸虫成虫切片上识别自然的日本血吸虫Calpain ,且大多数表达在成虫真皮层。结论　日本血吸虫钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)主要分布在成虫肌肉和真皮层 ,提示Cal pain可能是日本血吸虫的一个疫苗候选分子 ,并提示这个分子的重组抗原有可能应用于血吸虫病诊断。     

疟疾疫情预测GM(1,1)灰色模型的建立与应用效果分析

目的目的建立疟疾疫情预测模型GM（1,1）,探讨其应用于深圳市龙岗区疟疾发病率预测的可行性。方法根据1998～2004年龙岗区疟疾发病率数据建立疟疾发病率预测灰色模型GM（1,1）,并作拟合效果检验;外推预测2005年深圳市龙岗区疟疾发病率,将预测值与实际发病率比较,评价龙岗区2005年疟疾防治效果。结果疟疾发病率预测数学模型为^∧Y（t）=-12.8390e^-0.5398（t-1）＋19.9444,经拟合检验,模型拟合精度好（C=0.1559,P=1.000）。利用本模型对2005年深圳市龙岗区疟疾发病率进行外推,估计2005年龙岗区疟疾发病率为0.1224/10万,实际发病率为0.1799/10万,实际值比预测值高31.96%。结论GM（1,1）模型较好地拟合了龙岗区疟疾发病的趋势,预测结果具有一定的参考价值。龙岗区疟疾实际发病率高于预测值,提示疟疾防治工作需要巩固和加强。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

肠道病毒71型真核双基因表达载体的构建

目的通过克隆肠道病毒71型结构前体蛋白P1和非结构蛋白3CD,构建共表达P1前体蛋白和非结构蛋白3CD的真核双基因表达载体。方法设计合成脑心肌炎病毒(EMCV)IRES序列的特异性引物,克隆至真核表达载体pcDNA3.0上,命名为pc-IRES。从手足口病重症患者分离EV71病毒株,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增出EV71病毒的P1前体蛋白区与3CD区的片段,并将其定向克隆至真核表达载体pc-IRES载体中IRES序列的上游和下游,随后转化到大肠埃希菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果通过重组质粒p-IRES-P1-3CD进行酶切和DNA序列分析,重组真核双基因表达载体p-IRES-P1-3CD构建成功。结论成功构建共表达EV71病毒P1前体蛋白和非结构蛋白3CD真核双基因表达载体,这将为下一步制备基于DNA载体的EV71病毒的类病毒颗粒疫苗打下基础。