间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

重组Calpain蛋白的免疫原性及其诊断上的应用研究

目的研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫诊断上的应用. 方法用重组Calpain蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)产生特征;同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原,粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗,肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清. 结果重组Calpain抗原免疫小鼠后,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体,免疫4周后IgG类抗体达到高峰,与对照组鼠相比较,免疫鼠血清中IgG1, IgG2a, IgG2b特异性抗体也有显著性的上升; Calpain重组抗原血清诊断日本血吸虫和粪检的符合率为100%, 粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高, EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低, 与肝吸虫的交叉反应率为37%. 结论日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白,能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白,能够敏感地测定日本血吸虫的感染, 说明Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子.     

阴道毛滴虫长寿保障基因Tv-LAG1的克隆和表达

目的克隆原生动物阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)长寿保障基因[longevityassurancegene1(LAG1)]的同源基因Tv-LAG1。构建Tv-LAG1原核表达重组体及表达其融合蛋白。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中筛选LAG1的同源基因,用pET41表达载体与Tv-LAG1cDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物用SDS-PAGE法鉴定。用纯化的融合蛋白免疫家兔,获得抗血清,采用Western-blot法对抗体特异性进行分析鉴定。结果成功构建pET41/Tv-LAG1原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白。用融合蛋白免疫家兔获得的抗体能特异性识别Tv-Lag1p/GST融合蛋白。结论Tv-Lag1p/GST融合蛋白获得高效表达,并成功纯化,初步实验证明具有一定的免疫原性,为研究Tv-Lag1p在模式生物阴道毛滴虫的细胞定位以及其功能奠定了基础。     

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。     

日本血吸虫Calpain疫苗候选分子抗感染的免疫机制

目的探讨日本血吸虫疫苗候选分子—钙离子激活的中性蛋白激酶(Calpain)的保护性免疫力和免疫保护性机制。方法用重组纯化的Calpain抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗Calpain血清,抗Calpain血清与机械转化的日本血吸虫童虫和来自于同种鼠激活的嗜酸性粒细胞共同培养,观察细胞对血吸虫童虫的粘附及对童虫的杀伤效果;RT-PCR分析Calpain抗原免疫BALB/c小鼠一氧化氮激酶(iNos.eNos.nNos)mRNA的表达;ELISA分析免疫小鼠体外培养脾细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-4。结果重组Calpain抗原免疫小鼠后,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体,此抗体介导了同种鼠的嗜酸性粒细胞对日本血吸虫童虫的粘附,37℃、5%CO2培养48h后,33.8%的日本血吸虫童虫被杀死,与控制组14.5%的自然死亡率相比有一个显著性的增高(P<0.01);RT-PCR测定重组Calpain抗原免疫1周小鼠iNosmRNA的表达显著性的增强,培养24h脾细胞上清中IFN-γ浓度高于对照组。结论Calpain特异性抗体介导了对日本血吸虫童虫的细胞毒作用,Calpain抗原能够诱导IFN-γ的产生,提示Calpain诱导Th1的免疫应答反应来抗日本血吸虫的感染。     

深圳市淡水鱼华支睾吸虫感染调查及实验研究

目的了解深圳市淡水鱼华支睾吸虫(肝吸虫)囊蚴感染情况,阻断和控制肝吸虫病在深圳市的传播和流行。方法用鱼体消化法筛查肝吸虫囊蚴;以肝吸虫过氧化物酶(SOD)基因保守序列作为摸板,RT- PCR鉴别肝吸虫囊蚴。结果对深圳市淡水鱼肝吸虫感染情况进行调查,共抽检16种鱼257份样品,其中检出肝吸虫囊蚴45份,检出率为17．50％。检出率最高的鱼种依次为鲩鱼40．74％、鲮鱼26％、鲤鱼22．5％、大头鱼 22．85％、生鱼16．6％、非洲鲫鱼14．5％;RT-PCR检测结果与镜检结果完全一致。结论检测结果显示深圳市淡水鱼中肝吸虫的感染情况严重,尤其是鲩鱼的感染率较高,为了控制和阻断肝吸虫的传播必须改变吃淡水鱼生的生活习惯。