海藻酸钙微球与海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹对不同种类细胞生长的影响

目的:观察海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹对不同特性细胞生长的影响。方法:实验于2004-04/2005-04在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成。细胞:牛肾上腺嗜铬细胞、Swiss小鼠胚胎成纤维细胞株(3T3)、人早幼粒白血病细胞株。仪器和试剂:加拿大Sun氏静电微囊发生仪;体视显微镜;海藻酸钠,聚赖氨酸、氯化钙、柠檬酸钠。制备海藻酸钙微球和海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊,分别用其包裹3T3细胞、牛肾上腺嗜铬细胞及人早幼粒白血病细胞。按照细胞的不同及包裹材料的不同,分为裸细胞组、海藻酸钙微球组、海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊组。在光镜下观察体外培养的微球、微囊及细胞的形态、存活率、增殖率。细胞增殖率=培养后细胞数-培养前细胞数/培养前细胞数×100%。结果:光镜下见包裹后即刻海藻酸钙微球和海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊呈大小均一的半透明圆球,直径150～300μm,表面光滑。培养24h时,牛肾上腺嗜铬细胞、3T3或人早幼粒白血病细胞均呈单个细胞,均匀分散于微球或微囊内。培养120h时,牛肾上腺嗜铬细胞、3T3和人早幼粒白血病细胞在海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内聚集成团块,而在海藻酸钙微球内仍呈单个细胞散在分布。①海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内高增殖活性的3T3或人早幼粒白血病细胞的存活率显著高于牛肾上腺嗜铬细胞(74.38±7.72,89.08±3.05,87.48±3.43,92.40±7.56,72.67±2.08,89.33±5.13,P<0.01);海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内细胞存活率均显著高于海藻酸钙微球内同一种细胞的存活率(87.88±3.38,89.08±3.05,89.63±5.55,85.33±4.86,92.40±7.56,95.08±3.81,83.67±5.51,89.33±5.13,85.33±2.08,P<0.01)。②在不同状态下,培养72和120h时,人早幼粒白血病细胞或3T3细胞的增殖率存在差异,海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊内同种细胞的增殖率显著高于裸细胞组(2.54±0.65,5.20±2.38,2.30±0.70,2.26±0.83,3.89±1.89,13.37±16.14,P<0.05);而在不同状态下牛肾上腺嗜铬细胞的增殖率差异无显著性(P>0.05)。③在相同状态下,培养72和120h时,人早幼粒白血病细胞增殖率明显高于3T3或牛肾上腺嗜铬细胞(18.66±7.76,39.11±16.06,P<0.01);而3T3与牛肾上腺嗜铬细胞的增殖率差异无显著性(P>0.05)。④对同一种细胞,培养24,72和120h时,海藻酸钙微球与海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊相比,其细胞的增殖率差异均无显著性(P>0.05)。结论:在培养条件下,海藻酸钙微球或海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹似更利于该3种细胞的生长;海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙微囊包裹较海藻酸钙微球包裹更利于同种细胞的生长。     

PSNAV2.0-TNFα重组质粒的构建及其在体外的表达

目的:在前期微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,构建分泌型人肿瘤坏死因子α的真核表达载体PSNAV2.0-TNFα重组质粒,并鉴定其蛋白的体外瞬时表达,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗和改善疾病奠定基础。方法:实验于2006-06/2007-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学实验室完成。①以含有人肿瘤坏死因子αcDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得人肿瘤坏死因子α基因片段;将其定向插入真核表达载体PSNAV2.0中,获得重组质粒PSNAV2.0-TNFα。采用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。②利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾细胞HEK-293细胞中,构建可持续分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测转染细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子蛋白的体外瞬时表达。结果:①通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在HEK-293中插入片段正确。②采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有人肿瘤坏死因子α蛋白,Mr17000。结论:成功构建了重组质粒PSNAV2.0-TNFα真核表达载体,转染HEK-293细胞后可有效分泌人肿瘤坏死因子α蛋白,并能分泌到细胞外。     

微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞偏侧帕金森病样猴脑内移植研究

目的:观察微囊化牛肾上腺嗜铬细胞脑内移植对偏侧帕金森病样猴的行为影响、移植物的存活状况、脑组织液中单胺类物质含量的变化及纹状体区多巴胺D2受体的活动性。方法:实验于1999-01/2003-06在解放军总医院老年医学研究所完成。①右侧颈内动脉注射甲基-苯基-四氢吡啶诱发帕金森病样猴模型(n=9),随机分为微囊化牛肾上腺嗜铬细胞组6只、牛肾上腺嗜铬细胞组2只及空微囊组1只。②获取牛肾上腺嗜铬细胞,以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠为材料包裹牛肾上腺嗜铬细胞,将微囊化、非囊化牛肾上腺嗜铬细胞或空微囊分别植入微囊化牛肾上腺嗜铬细胞组、牛肾上腺嗜铬细胞组及空微囊组帕金森病样猴右侧尾状核和壳核。③观察3组帕金森病样猴移植后的行为改善、移植后14个月及28个月时移植物的状况,微囊化牛肾上腺嗜铬细胞组移植后2个月及7个月时移植区微透析液中单胺类物质变化及48个月时多巴胺D2受体的活动性变化。结果:①囊化牛肾上腺嗜铬细胞组(n=6)和牛肾上腺嗜铬细胞组(n=2)移植后1周开始帕金森病样猴左上肢活动明显增加,囊化牛肾上腺嗜铬细胞组改善时间7～48个月,牛肾上腺嗜铬细胞组一两个月,空微囊组(n=1)左侧上肢活动无改善。②囊化牛肾上腺嗜铬细胞植入28个月时仍存活于帕金森病样猴脑内。③囊化牛肾上腺嗜铬细胞组移植后2,7个月时,右侧壳核、尾状核细胞外液中多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸和高香草酸水平较移植前明显提高(P<0.05),但仍低于左侧的水平。④囊化牛肾上腺嗜铬细胞移植48个月时移植区D2受体活性较对侧明显提高。结论:结果表明帕金森病样猴脑内移植的囊化牛肾上腺嗜铬细胞能够长期存活、产生多巴胺、改善其异常行为。     

转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞药物转化功能的测定

目的了解转染SV40基因对正常成人肝细胞药物转化功能的影响。方法高效液相色谱法检测肝细胞对利多卡因的转化能力;Western blotting法检测两种肝细胞内细胞色素P450的表达。结果转染前、后肝细胞中利多卡因的浓度两者的利多卡因转化率无明显差异;两组肝细胞在蛋白电泳后都出现了54kU的蛋白条带,表明两种细胞均能表达细胞色素P450,均具有P4502E的免疫反应性。结论转染永生化基因前后的正常成人肝细胞均具有药物代谢所必需的细胞色素P450酶蛋白,仍保持了正常成人肝细胞的代谢功能。     

脊髓蛛网膜下腔植入海藻酸钠微囊化阿片肽能细胞对吗啡依赖大鼠戒断反应的影响

目的:观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化阿片肽能细胞(alginate-polylysine-alginatemicrocapsuleofopiumpeptidecell/B-1,A-PA-OPC/B-1)脊髓蛛网膜下腔移植后对吗啡依赖大鼠戒断反应的影响,证实APA-OPC/B-1对药物依赖所产生戒断症状的改善作用。方法:取成年健康雄性Wistar大鼠35只,采用逐日多次增量注射吗啡的方法,造成吗啡依赖性模型大鼠,其中26只模型建立成功。将模型大鼠随机分为APA-OPC/B-1组(n=13),美沙酮组(n=5)和生理盐水组(n=8)。在腹腔注射纳洛酮催瘾后,观察不同药物治疗组模型大鼠的戒断症状评分,体质量下降值,大鼠血液一氧化氮和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)水平变化。结果:APA-OPC/B-1组的模型大鼠体质量下降值犤24h:(22.36±3.12)g,48h:(19.06±2.56)g,72h:(17.94±3.56)g,96h:(15.25±4.01)g犦及第2次催瘾时戒断症状评分犤(6.81±0.26)分犦明显低于与生理盐水组犤24h:(34.13±4.46)g,48h:(29.87±5.69)g,72h:(24.54±5.01)g,96h:(25.20±4.68)g,(7.63±0.48)分犦(t=-7.14～-3.54,P<0.01)。APA-OPC/B-1组的模型大鼠两次催瘾后戒断症状评分与美沙酮组比较,差异也有显著性意义(t=4.87～8.72,P<0.01)。吗啡依赖大鼠在给予美沙酮后1,48及96h时,其血液一氧化氮和SOD水平显著     

远红外热像图对烟雾病诊断价值的探讨

目的通过分析烟雾病患者远红外热像图的变化,探讨红外热像仪在烟雾病诊断中的价值。方法将解放军总医院临床诊断为烟雾病的患者28例作为患者组,30例健康体检者作为正常对照组,受检者暴露检查部位。检查在环境温度为20℃~25℃的检查室中进行。使用远红外热像仪采图,同时对人体头面部的红外热像图进行分析,观察烟雾病患者组与正常对照组的身体各部位左右两侧的温差变化,并进行统计学分析。结果 28例烟雾病患者的红外热像图中,头面部充血性改变呈红色或深红色,缺血性改变呈蓝色或浅绿色。患者组的额颞区、内眦区两侧对称区域温度差值明显大于正常组,差异有统计学意义(t=1.453,1.636,P0.05)。结论红外热像图可通过皮肤温度变化,敏感地反映烟雾病患者的身体热分布及功能状况,对于烟雾病诊断具有重要价值。     

微囊化牛嗜铬细胞移植于脊髓蛛网膜下镇痛作用的研究

采用微囊化牛嗜铬细胞（ＢＣＣ）异种移植于大鼠和癌痛病人疹髓蛛网膜下方法,观察ＢＣＣ镇痛作用和海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠（ＡＰＡ）微衰对异种移植物的免疫保护作用。结果显示,移植后微囊组和非微囊组织大鼠基础热痛阈和尼古丁激发热痛阈明显升高,微囊组８０％受试鼠的镇痛特续时间超过２７０天,将微囊化ＢＣＣ樾入８例癌痛疾人朱网膜下,除１例痛效果不明显外７例缓解,减少或停止使用止痛药,镇痛作用持续时间〉６０天     

微囊化件肾上腺髓质嗜铬细胞脑内移植治疗偏侧帕金森病样大 …

以右侧帕金森病样大鼠和猴为模型,分别将微囊化和非微囊化牛肾上腺嗜铬细胞（ＢＣＣ）及空微囊定向植入右侧脑纹状体内,观察动物行为、脑组织生化和组织变化。结果表明,植入的ＢＣＣ能够在异种脑内存活,分泌多巴胺等单胺类物质并纠正帕金森病样大鼠及猴的异常行为。海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠微囊具有免疫保护作用,可明显地延长ＢＣＣ在异种宿主脑内的顾活时间,作用超过１０个月。微囊化ＢＣＣ脑内移植有望成为治疗帕金森病     

TECA-I型生物人工肝脏支持系统治疗肝脏大部切除急性肝衰犬的研究

目的 :在引进和发展ＴＥＣＡ -Ｉ型生物人工肝脏支持系统 (ＢＡＬＳＳ) ,安全有效地治疗药物诱发急性肝衰犬的基础上 ,进一步了解ＢＡＬＳＳ替代肝脏大部切除急性肝衰犬肝功能的效应 ,以为急性肝衰者提供肝组织再生修复的机会。方法 :研究采用肝脏切除 75%～ 80 %的方法建立急性肝衰模型犬 :将酶消化获得的中国实验用小型猪肝细胞培养于ＴＥＣＡ -Ｉ型ＢＡＬＳＳ的生物反应器中 ,通过中空纤维管膜与肝衰犬的血液进行物质交换 6ｈ ;并以药物治疗组和无肝细胞透析组作为对照。结果 :肝脏大部切除术后 2 4ｈ开始 ,犬血ＮＨ3、ＧＰＴ、ＧＯＴ、…     

帕金森病样大鼠模型的稳定性观察

6-OHDA损毁大鼠一侧中脑黑质细胞造成偏侧帕金森病(PD)样大鼠模型,用小动物旋转行为记录仪记录阿朴吗啡诱发大鼠的旋转行为;TH免疫细胞化学染色观察中脑黑质细胞的损毁状况.连续观察10个月其旋转行为无自发性恢复;PD样模型大鼠损毁侧中脑无TH阳性细胞存在.结果表明6-OHDA损毁大鼠一侧中脑黑质细胞可造成稳定、可靠的类似PD病人病理变化的偏侧动物模型.