体外培养APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响

背景：积极探索结肠癌相关基因及抑癌基因已成为新的研究热点,人肿瘤坏死因子α是一个重要的促炎因子和免疫调节因子,对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效。目的：观察体外培养海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine-alginate,APA）微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响。方法：采用前期建立的制备方法,用APA微囊分别包裹人肿瘤坏死因子α/293细胞,APA微囊化0/293细胞。取对数生长期结肠癌（Lovo）细胞,配制成所需浓度的细胞悬液,接种24孔板培养,分别加入低、中、高剂量稳定转染的APA微囊化肿瘤坏死因子α/293,即分为5个实验组,APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组为APA微囊化0/293细胞组,阳性组加入肿瘤坏死因子α,MTT法检测490nm吸光度;通过对人肿瘤细胞增殖抑制实验,观察对结肠癌细胞（Lovo）增殖的抑制作用。结果与结论：体外培养中,加入APA微囊化0/293细胞组对结肠癌细胞增殖无抑制作用;而APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞中、高剂量组和阳性组,在24,48,72h的A值低于APA微囊化0/293细胞组（P〈0.05）,提示APA微囊化人肿瘤坏死因子α/293细胞所分泌肿瘤坏死因子α对结肠癌细胞有增殖抑制效应,均呈现出良好的数量依赖关系。     

体外培养APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响

背景:积极探索结肠癌相关基因及抑癌基因已成为新的研究热点,人肿瘤坏死因子α是一个重要的促炎因子和免疫调节因子,对肿瘤的免疫治疗具有一定的疗效。目的:观察体外培养海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞对结肠癌细胞增殖的影响。方法:采用前期建立的制备方法,用APA微囊分别包裹人肿瘤坏死因子α/293细胞,APA微囊化0/293细胞。取对数生长期结肠癌(Lovo)细胞,配制成所需浓度的细胞悬液,接种24孔板培养,分别加入低、中、高剂量稳定转染的APA微囊化肿瘤坏死因子α/293,即分为5个实验组,APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞低剂量组、中剂量组、高剂量组、阴性组为APA微囊化0/293细胞组,阳性组加入肿瘤坏死因子α,MTT法检测490nm吸光度;通过对人肿瘤细胞增殖抑制实验,观察对结肠癌细胞(Lovo)增殖的抑制作用。结果与结论:体外培养中,加入APA微囊化0/293细胞组对结肠癌细胞增殖无抑制作用;而APA微囊化肿瘤坏死因子α/293细胞中、高剂量组和阳性组,在24,48,72h的A值低于APA微囊化0/293细胞组(P<0.05),提示APA微囊化人肿瘤坏死因子α/293细胞所分泌肿瘤坏死因子α对结肠癌细胞有增殖抑制效应,均呈现出良好的数量依赖关系。     

大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景:Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色.虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题.目的:构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成.材料:pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5 α、293细胞为自备.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆AktlDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind m的酶切位点,构建Akt1真核表达载体Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞.主要观察指标:蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达.结果:经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符.将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达.结论:构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达.     

重组人肿瘤坏死因子α分泌型真核表达载体的构建及表达

目的构建人肿瘤坏死因子rhTNF—α分泌型真核表达载体,并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达。方法以pGEM—T／sig—tumstatin为模板,扩增与TNF带重叠区的Ⅳ型胶原信号肽sig基因片段,以PBV220-TNF为模板,扩增与sig带重叠区的TNF基因片段,以上述2个扩增产物片段为模板,重叠区扩增拼接法（SOEing）扩增得到sig—TNF。sig—TNF片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定,对获得的sig—TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig—TNF真核表达载体转染到CHO—K1,并对其表达状况进行检测。结果所获得的sig—TNF片段（558bp）序列与报道的序列完全一致,酶切鉴定结果表明含人肿瘤坏死因子的重组pIRESneo3／sig-TNF表达载体构建成功,转染重组pIRESneo3／sig—TNF的CHO—K1分泌表达了人肿瘤坏死因子rhTNF—α。转染了pIRESneo3／sig—TNF真核表达载体和空载体的CHO—K1和未转染CHO—K1细胞的生长速度没有差别。结论成功构建了重组人肿瘤坏死因子rhTNF—α分泌型真核表达载体,并获得能稳定表达rhTNF—α的CHO—K1,为开展下一步的实验奠定了基础。     

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2（IL-2）分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。     

小分子干扰RNA真核表达载体阻断U937细胞肿瘤坏死因子α基因的表达

背景:无菌性松动是导致人工关节置换后失败和降低人工关节使用寿命的主要原因,肿瘤坏死因子α是一个极具吸引力的无菌性松动治疗新靶点.小分子干扰RNA作为一种新型的基因阻断技术,被广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定、信号转导研究以及基因治疗方面,显示出广阔的应用前景.目的:构建人肿瘤坏死因子α基因的小分子干扰RNA真核表达载体,观察其对U937细胞中肿瘤坏死因子α基因表达的干涉作用.方法:将合成的2对小分子干扰RNA寡核苷酸链分别退火形成双链,连接入pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体,分别命名为pSilencer-T1和pSilencer-T2,经酶切及测序鉴定.电转染法转染重组质粒入U937细胞,G418筛选后反转录-聚合酶链反应检测其对肿瘤坏死因子α基因mRNA的干涉效果.结果与结论:经酶切及测序鉴定,成功构建了siRNA真核表达载体,经电转染法转染U937细胞后,反转录-聚合酶链反应显示所构建的干涉肿瘤坏死因子α基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,U937细胞中肿瘤坏死因子α基因的mRNA表达水平明显降低.提示成功构建了人肿瘤坏死因子α基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer-T1和pSilencer-T2,并在U937细胞中有效地发挥了对肿瘤坏死因子α基因表达的干涉作用.     

重组人pEGFP-C2-NPHS2表达载体的构建及其在人胚胎肾293细胞中的表达

目的:构建人pEGFP-C2-NPHS2表达载体,并观察其在人胚胎肾(HEK)293细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白与NPHS2的融合表达载体,经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定,应用基因转染技术将其转入HEK293细胞中,荧光显微镜和免疫印迹检测NPHS2的表达产物podocin.结果:经鉴定目的基因NPHS2全长插入重组质粒,HEK293细胞不表达NPHS2基因,转染后可以检测到绿色荧光蛋白分布于细胞的膜周部,免疫印迹证实为编码蛋白podocin.结论:成功构建重组人pEGFP-C2-NPHS2表达载体,有助于进一步研究podocin在足细胞疾病中的作用.     

HBsAg真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建HBsAg真核表达载体,转染CHO细胞并检测其表达。方法通过PCR法扩增出乙肝表面抗原的S基因和dhfr基因,分别克隆到T载体上,然后分别将S基因和dhfr基因克隆到pCI载体上,将pCI载体的CMV启动子替换为hEF-1α启动子。对新构建的pEF1-αS-dhfr真核表达载体进行酶切和测序鉴定。用脂质体法转染CHO(dhfr-)细胞,并用ELISA法检测HBsAg表达。结果hEF-1α启动子、S基因和dhfr基因经测序与Genbank报道一致。真核表达载体pEF1-αS-dhfr经酶切鉴定与预期一致。转染重组质粒后的CHO细胞成功表达了HBsAg。结论已成功构建了真核表达载体pEF1-αS-dhfr,为研究高效表达HBsAg奠定了良好的实验基础。     

小鼠Cdc14A基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠pcDNA3.1-MYC-细胞分裂周期14A(Cdc14A)真核表达载体,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法将化学合成的目的基因Cdc14A定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定正确后,采用脂质体法转染HEK293细胞,通过Western blot检测细胞内Cdc14A的表达,并检测Cdc14A基因序列。结果 pcDNA3.1-MYC-Cdc14A真核表达载体构建成功,将其转染HEK293细胞48h,提取细胞蛋白,采用Western blot检测到细胞内Cdc14A的表达,并且测序结果与预期结果一致。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A,为研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的作用奠定了基础。     

AMPKα2基因克隆及其野生型和突变型真核表达载体的构建

背景:实验表明,通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase, AMPK)α2可以增加胰岛素的敏感性和骨骼肌葡萄糖的摄取,其有望成为预防和治疗2型糖尿病的新的生理和药理作用靶点.目的:克隆人的AMPKα2基因,并构建其野生型和突变型真核表达载体.设计:单一样本观察.时间及地点:实验于2007-04/2008-01在中山大学附属第二医院临床分子生物实验室完成.材料:QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit为Stratagene公司产品.真核表达载体pcDNA3.1(+),大肠杆菌DH5α为实验室保存.人骨胳肌组织来源于中山大学附属第二医院手术截肢患者,获患者知情同意,新鲜取材后液氮冷冻.方法:采用反转录一聚合酶链反应技术从人骨骼肌扩增AMPKα2基因,并将其克隆到T载体,通过测序对其进行鉴定.采用Quickchange定点诱变试剂盒对AMPKα2基因进行体外定点诱变,并将其野生和突变的编码基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,通过酶切和测序进行鉴定.主要观察指标:①目的基因的克隆.②定点诱变.③真核表达质粒的构建.结果:成功克隆了AMPKα2基因,大小约1 700 bp,与已发表的AMPKα2同源性为99%,GenBank录入号EF056019.成功将AMPKα2第45位Lysine(AAA)突变为Arginine(AGA),成功构建了野生型和突变型pcDNA-AMPK α2重组质粒.结论:实验成功克隆了AMPKα2基因,构建了其野生型和突变型真核表达载体.     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

肺表面活性物质相关蛋白C真核表达载体的构建及体外表达

目的 克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SP-C,并检测其在体外的表达,为SP-C的批量生产提供可靠的方法.方法 提取肺癌手术患者病灶周围正常肺组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得SP-C cDNA序列.用NotI和XhoI内切酶双酶切SP-C cDNA序列和质粒pcDNA3.1(+),胶回收后体外连接.酶切和测序后,用脂质体包裹转染人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SP-C的表达.结果 能够正确克隆人SP-C基因并插入至质粒pcDNA3.1(+)中;重组质粒体外转染MCF-7细胞后可以表达SP-C蛋白.结论 采用体外重组技术,成功构建了人SP-C真核表达载体 pcDNA3.1(+)/SP-C,并能在体外表达SP-C,为下一步构建人SP-C乳腺特异表达载体,利用乳腺生物反应器大量生产SP-C奠定了基础.     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

构建两种启动子调控的自杀基因介导的肝癌细胞治疗

目的将外源基因p Survivin-HSV-TK导入质粒PBI-CMV2中,将外源基因p AFP-HSV-TK导入质粒PBI-CMV2中,构建两种特异性表达的质粒,比较两种启动子调停的优越性。方法由阳离子脂质体lipofectamine2000TM,运载两种质粒转染肝癌细胞Hu H-7,流式细胞术测定转染效率,半定量PCR检测TK基因在肝癌细胞中的表达水平。转染肝癌细胞Hu H-7,联合更昔洛韦杀伤细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率,CCK-8检测加药(GCV)后细胞的增殖情况。结果阳离子脂质体lipofectamine2000TM介导Survivin-TK-p BI-CMV2质粒转染的Hu H-7细胞的转染率与介导AFP-TK-p BI-CMV2质粒转染的Hu H-7细胞的转染率分别为(14.43±0.88)%和(12.51±1.74)%(P=0.38),无统计学差异。半定量PCR检测HSVtk在转染的Hu H-7细胞中有表达,且转染Survivin-TK-p BI-CMV2质粒的细胞中TK基因的表达更高(P=0.001),在未转染细胞内未检测到表达。细胞凋亡实验表明GCV对转染的Hu H-7细胞有显著的杀伤作用,且转染Survivin-TK-p BI-CMV2质粒的Hu H-7细胞凋亡作用更明显(P=0.001)。结论肝细胞靶向基因运输载体PBI-CMV2介导的由AFP和Survivin启动子调控的HSVtk/GCV自杀基因系统对Hu H-7肝癌细胞均具有显著杀伤作用,且Survivin启动子调控作用相对明显,这为肝癌的靶向基因治疗策略的发展提供了新思路。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

C反应蛋白质粒的构建表达及纯化

目的 在大肠埃希菌中表达和纯化C反应蛋白（CRP），并鉴定纯化蛋白的免疫反应性，为CRP的检测打基础。方法 应用逆转录（RT）PCR方法，从人肝细胞文库中扩增人C反应蛋白cDNA基因片段，与表达质粒载体pCRT7／NTTOPO重组，获得表达质粒CRP—pCRT7／NT。用氨苄青霉素平板筛选转化子，双酶切与DNA测序鉴定CRP基因表达质粒pCRT7／NTTOPO载体的整合状态，用IPTG诱导表达，并经组氨酸亲和层析柱纯化获得CRP的蛋白纯品。采用Western印迹的方法鉴定纯化蛋白的免疫反应性。结果 利用表达载体pCRT7／NTTOPO载体表达的含6个组氨酸标签的CRP，在SDS—PAGE上出现1条相对分子质量约30000的阳性条带，经组氨酸亲和层析柱纯化后用Western印迹杂交证实为目的蛋白。结论 成功地构建了在大肠埃希菌表达CRP的质粒，建立了蛋白纯化的系统，为下一步CRP检测试剂盒的制备打下了基础。     

血管性血友病因子Ala 737→Glu突变体的构建和表达

目的 研究血管性血友病因子Ａｌａ７３７→Ｇｌｕ突变对ｖＷＦ功能的影响,分析ｖＷＦＡｌａ７３７→Ｇｌｕ突变致２Ａ型血管性血友病的分子病理机制。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法对野生型的ｖＷＦ全长表达质粒进行体外定点诱变,在ＣＯＳ－７细胞中进行表达。     

人缺失型Midkine重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

目的获得兔抗人缺失型Midkine(t MK)的多克隆抗体,并将其初步应用于临床检测。方法将人t MK蛋白经亲和层析法纯化,并将其作为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗人血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗人t MK多克隆抗体,用免疫组织化学和蛋白印迹(Western blot)试验检测抗体的灵敏度和特异性。结果获得初步纯化的兔抗人t MK特异性多克隆抗体,该抗体能识别天然人t MK蛋白。结论制备的t MK多克隆抗体可初步用于临床检测。     

Tat融合蛋白表达载体TAT-c-Myc的克隆化及蛋白表达研究

目的构建重组表达载体TAT-c-Myc,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。方法经PCR获得编码人c-Myc的全基因序列,含有设计的限制性酶切位点的产物连接到含有TAT转导结构的原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-c-Myc,转化大肠杆菌,应用IPTG诱导TAT-c-Myc融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化,并应用Western blot检测蛋白的特异性,融合蛋白转导人皮肤成纤维(HSF)细胞的效果应用免疫荧光检测。结果成功构建了TAT-c-Myc融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达。Western blot检测提示融合蛋白有良好的特异性。免疫荧光检测提示融合蛋白具有快速转导入HSF细胞内的能力。结论为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础。     

3种丙型肝炎病毒结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建鉴定及表达

目的：构建能表达HCV不同结构基因（C、C E1、C E1 E2）的腺病毒表达载体的穿梭质粒，为进一步包装能高效表达HCV不同结构蛋白的腺病毒载体做准备。方法：用分别含有Bg1 Ⅱ及HindⅢ酶切位点的HCV不同片段结构基因上、下游引物，以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV-3011为模板，通过PCR扩增获得HCV3种不同结构基因片段，基因片段回收后，分别以BglⅡ及Hing Ⅲ双酶切，定向插入到腺病毒穿梭质粒Pad.CMV-Link.1中CMV启动子下游Bgl Ⅱ与HindⅢ位点之间。获得3种重组腺病毒穿腺病毒穿梭质粒pad.HCV-C、Pad.HCV-CE1和Pad.HCV-S(C E1 E2)。通过Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切，聚合酶链反应（PCR）及插入片段序列测定对质粒进行了三重鉴定，以抗HCV C单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法及Western Blot检测了3种穿梭质粒在HepG2细胞中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，3种穿梭质粒的插入片段分别为HCV C、C E1和C E1 E2区基因片段，免疫荧光及Western Blot法检测表明其可以在HepG2细胞中瞬时表达。结论：构建的3种腺病毒穿梭质粒分别可以表达HCV不同段的结构基因，为包装表达HCV不同结构基因的腺病毒载体奠定了基础。