骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

一种新型数据库在内镜室管理中的应用

近年来，计算机技术发展迅速，逐步进入各医院的日常管理中。我们尝试使用Microsofr的Access软件建立了一个数据库系统，对内镜室的病案资料及科室人员资料进行综合管理，避免了以往低效的手工书档案统计。现具体介绍如下。     

微小磁珠法分离胚胎大鼠神经干细胞的实验研究

目的　旨在以微小免疫磁珠 (平均直径≤ 5 0 nm)分离提纯 SD大鼠胚胎大脑皮层组织中的神经干细胞并进行培养 ,观察细胞的增殖分化情况并对其分化产物进行鉴定 ,评价该分离方法的可行性及其在神经干细胞研究中的应用价值。方法　取 SD大鼠的胚胎大脑皮层组织制单细胞悬液 ,用微小磁珠分选出神经巢蛋白(nestin)阳性的细胞群 ,光镜下检测其纯度及活力后进行体外培养 ,特定条件下诱导分化并以免疫细胞方法检测产物的细胞类型。结果　分离的神经干细胞纯度为 (89.2± 4.8) % ,细胞存活率 (97.0± 1 .6) % ,诱导分化产物中出现 NSE阳性、GFAP阳性、巢蛋白 (nestin)反应阳性细胞群落。结论　微小磁珠法分离提纯神经干细胞纯度高 ,获得细胞数多 ,并对细胞的生物活性无明显影响 ,提纯的细胞可用于后续实验     

高温对血脑屏障内皮细胞紧密连接的作用及其机制

目的　探讨高温对血脑屏障内皮细胞间紧密连接的影响及其分子机制。　方法　利用内皮细胞与胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。采用Millicell-ERS系统检测血脑屏障模型的跨内皮阻抗 (transendothelialresistance,TER)。对内皮细胞间紧密连接采用银染的方法研究其结构的完整性。运用半定量逆转录 -聚合酶链式反应 (RT -PCR)及Westernblotting的方法分析高温作用后血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白 (zonulaoccluden 1,ZO - 1)与occludin的表达变化。　结果　 4 3℃高温作用 2h后 ,体外血脑屏障模型TER均值由 (32 1.30± 5 8.5 9)Ω·cm2 下降至 (6 5 .6 7± 6 .0 2 )Ω·cm2 。同时 ,内皮细胞紧密连接完整性明显破坏 ,内皮细胞ZO - 1及occludin的表达水平明显降低。　结论　高温可以明显破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接的完整性 ,高温条件下内皮细胞ZO - 1与occludin表达水平的降低是血脑屏障热损伤的重要分子机制。     

神经元膜NMDA受体蛋白免疫复合物单分子纳米结构及定位AFM比较研究

目的探讨NMDAr(N-甲基-D-天冬氨酸受体)在神经细胞膜表面定位，对比不同成像方法的特点，建立纳米尺度神经细胞膜表面蛋白单分子三维标记的免疫细胞化学新方法。方法应用原子力显微镜，对分布在云母表面的抗NMDAR1亚单位IgG-葡萄球菌蛋白A-胶体金颗粒免疫标记复合物分子进行扫描，明确其特定的三维结构作为对照标准，然后扫描结合了免疫标记复合物分子的神经细胞膜表面，对表面形貌作出对比后确定目的抗原的定位和复合物三维结构。并与光镜、激光共聚焦、扫描电镜等方法进行对比。结果在空白云母表面，免疫复合物分子在原子力显微镜下呈现出均匀分散粒径为49nm的特征性球形结构。在神经元表面结合免疫标记物后可以发现有大量的粒径为53nm的球形或双球形(短棒状)结构，颗粒均匀，截面为双峰或单峰。光镜下染色成片状结果，在共聚焦显微镜下荧光呈颗粒点状分布，扫描电镜结果为单个或结合颗粒，缺乏三维成像能力。结论原子力显微镜下免疫胶体金标记技术可以在纳米尺度对目的膜受体蛋白进行定位和表面三维结构测定。NM-DA受体蛋白可以结合一个或两个胶体金复合物，与传统成像手段相比，原子力显微镜下胶体金标记方法可以对单个膜NMDA受体蛋白抗原进行定位、定性、定量标记测定。     

骨髓基质细胞诱导分化为去甲肾上素能神经元的实验研究

目的:研究骨髓源性神经干细胞在体外培养及诱导分化的神经元样细胞,能否分泌去甲肾上素神经递质成分,进而初步推断是否具有神经元的生化特征。方法:分离新西兰大白兔骨髓基质细胞(bonemarrowstemcells,BMSCs),在体外应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化,采用免疫细胞化学方法进行鉴定;并应用高效液相色谱法(highper-formanceliquidchromatograpy,HPLC)检测其去甲肾上素神经递质的含量。结果:BMSCs培养14d可见大而圆细胞,免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性,高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到去甲肾上素神经递质,经体外培养增殖7,14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则均可检测到去甲肾上腺素(noradrenaline,NE),培养第7,14,20天每107细胞中NE水平分别为:(4.270±0.376),(14.203±0.771),(45.970±4.902)μg/L,第7,14天NE含量小于第20天(F=172.44,P=0.011)。而且随着BMSCs培养天数的增加,其所含的NE浓度也渐增加(P<0.05)。结论:兔BMSCs能在体外增殖,并表达Nestin抗原;而且,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,表达成熟神经元特异性核蛋白NeuN,并合成、分泌去甲肾上腺素     

白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合对骨髓源性神经干细胞体外诱导分化的影响

目的：比较白细胞介素1α与胶质细胞源神经营养因子不同组合条件下骨髓基质细胞分化情况，探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞及多巴胺能神经元的分化条件。方法：2005-03／09在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所进行。①实验分组：实验分为空白对照组；胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素ld组，后者又分为10μg/L＋100ng/L,10μg/L＋200ng/L,20μg/L＋100ng/L,20μg/L＋200ng/L,1000μg/L＋100ng/L组。②细胞模型制作：用全骨髓法培养骨髓基质细胞。③骨髓基质细胞以5&;#215;10^8L^-1接种，悬浮于本实验室配制的神经干细胞培养基中。空白对照组：血清终浓度为体积分数为0．1的胎牛血清。细胞接种48h后，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α各组分别加人相应质量浓度的胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α。④应用Olympus光学显微镜观察细胞抗-神经巢蛋白和D2受体阳性染色阳性细胞数目计数。结果：①加人胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α增殖培养48h可见细胞分裂相。②诱导6d，部分细胞有神经巢蛋白成分表达。③3周测出DA受体D2检测阳性，胶质细胞源神经营养因子＋白细胞介素1α 10μg/L＋100ng／L组细胞诱导分化率显著高于10μg/L＋200ng／L，20μg/L＋100ng／L，20μg/L＋200ng／L，1000μg/L＋100ng／L组及空白对照组[依次为：（11.70&;#177;0.55）％，（3.62&;#177;0．78）％，（4．14&;#177;0．41）％，（3.3&;#177;0．63）％，（4．92&;#177;0．34）％，（1．61&;#177;0．68）％，P〈0．05或0.01].结论：骨髓基质细胞在体外培养条件下，经过胶质细胞源神经营养因子、白细胞介素1α诱导分化作用，配合使用高浓度（体积分数为0．1）血清可获得巢蛋白阳性的神经前体细胞及表达D2受体阳性的多巴胺能神经元；10μg/L＋100ng／L为最佳诱导分化质量浓度。     

兔脊髓损伤不同时期的神经干细胞移植治疗的效果

目的:研究新西兰大白兔脊髓损伤后不同时期神经干细胞(neuralstemcells,NSCS)移植治疗的不同效果,探讨脊髓损伤移植治疗的最佳时机。方法:体外培养、诱导新西兰大白兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)为NSC并行5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxyuridine/5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记。手术造成兔脊髓全横断模型,在术后即时,7,14,21,28d分别行NSC局部移植,同时设立脊髓全横断空白对照组,正常对照组。于移植后3个月观察动物脊髓损伤局部病理变化。结果:术后即时移植组局部仅有少量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目少;7,14d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目多,神经纤维排列较整齐;21,28d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,但通过脊髓损伤区的神经纤维数目少,且再生的神经纤维排列紊乱;空白对照组未发现Brdu标记阳性细胞,在脊髓损伤区域未发现再生通过的神经纤维。结论:实验证明了脊髓损伤后7～14d为NSC最佳移植时期,同时提示NSC移植对动物脊髓损伤后的组织修复具有促进作用。     

原代培养大鼠皮层神经细胞膜NMDAr蛋白冰冻蚀刻电镜研究

目的研究N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAr）蛋白免疫金颗粒复合物在神经元膜超微结构及定位。方法应用冰冻蚀刻电镜技术对神经元膜NMDAr蛋白复合物进行研究。结果沿神经细胞膜面可见30—50nm免疫金复合物散在或密集分布，大小均匀。细胞核上密集均匀分布膜内微粒，4～16nm，与胶体金颗粒（CGP）区别较大。结论膜蛋白免疫金复合物沿膜面散在分布，大小均匀。冰冻蚀刻复型-透射电镜技术具有NMDAr蛋白免疫胶体金颗粒免疫复合物原位纳米尺度定位能力。     

兔脊髓损伤不同时期的神经干细胞移植治疗的效果

目的：研究新西兰大白兔脊髓损伤后不同时期神经干细胞(neuralstem cells，NSCS)移植治疗的不同效果，探讨脊髓损伤移植治疗的最佳时机。方法：体外培养、诱导新西兰大白兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)为NSC并行5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxy uridine／5-bromo-2-deoxy uridine，BrdU)标记。手术造成兔脊髓全横断模型。在术后即时，7，14，21，28d分别行NSC局部移植，同时设立脊髓全横断空白对照组，正常对照组。于移植后3个月观察动物脊髓损伤局部病理变化。结果：术后即时移植组局部仅有少量Brdu标记阳性细胞存活，通过脊髓损伤区的神经纤维数目少；7，14d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活，通过脊髓损伤区的神经纤维数目多。神经纤维排列较整齐；21，28d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活，但通过脊髓损伤区的神经纤维数目少，且再生的神经纤维排列紊乱；空白对照组未发现Brdu标记阳性细胞，在脊髓损伤区域未发现再生通过的神经纤维。结论：实验证明了脊髓损伤后7～14d为NSC最佳移植时期，同时提示NSC移植对动物脊髓损伤后的组织修复具有促进作用。