rAdCDES的构建及对人肿瘤细胞抑制作用

目的:构建一种对肿瘤有直接和间接治疗作用的重组腺病毒rAdCDES。在体外进行抑瘤实验研究。方法:用PCR法扩增CD和glyES基因片段,插入腺病毒穿梭质粒。用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES。用MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的生长抑制情况。结果:成功构建了rAdCDES,其病毒滴度为1×1010.3TCID50/ml;rAdCDES在体外对人的MCF-7、A549、SMMC-77213种肿瘤细胞有明显抑制作用,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P<0.01)。结论:rAdCDES在体外对肿瘤细胞有明显的抑制作用,为其用于基因治疗奠定了基础。     

一种简易、廉价、高效构建重组腺病毒载体的方法

目的：建立构建重组腺病毒载体的简易、廉价、高效方法，为进一步应用含自杀基因的重组腺病毒治疗恶性肿瘤奠定基础。方法：Pme Ⅰ线性化腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV、切胶纯化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1按一定比例混合后，以化学转化法导人大肠杆菌BJ 5 183，在菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP。以脂质体法将重组质粒转染293细胞包装重组腺病毒rAdGFP。结果：细菌内同源重组率高达80％；在293细胞中成功产生重组腺病毒。结论：对目前应用广泛的AdEasy系统进行了有效改进，在获得较高阳性重组率的同时，降低了对实验室设备的要求。     

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术（重叠延伸PCR）并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES（internal ribosome entry site）的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备.方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3＇端与IRES基因5＇端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段.结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段.结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值.     

树突状细胞与肿瘤的免疫治疗

肿瘤具有抗原性,这为肿瘤的免疫治疗提供了理论依据。然而肿瘤却可以逃避宿主的免疫监视,致使用自体肿瘤细胞制备的瘤苗进行免疫治疗在很多情况下效果不理想。造成这些现象的主要原因是:(1)肿瘤细胞主要组织相容抗原复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)分子表达下调。(2)肿瘤细胞缺乏活化淋巴细胞所需的粘附分子(ICAMs,IFA_3)和协同刺激分子(B7)。(3)荷瘤宿主的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)提呈抗原能力存在缺陷。因此肿瘤抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞并产生相应的抗肿瘤免疫。如何提高肿瘤的免疫原性并有效     

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的：构建含胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）重组腺病毒（AdE1CMVCD），并鉴定；用自杀基因治疗系统（AdE1CMVCD/5-FC）对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法：体外实验：用不同稀释度的AdE1CMVCD)转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶（5-FC），用MTT法检测OD570nm值，按公式计算细胞生长抑制率；体内实验：建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型，瘤体内导入AdE1CMVCD，腹腔注射5-Fc，观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果：该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加，最大抑制率达61.29％，同时观察到了明显的旁杀伤作用；在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用，明显延长荷瘤小鼠生存期。结论：本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用，为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。     

腺病毒介导CDES融合基因对乳腺癌细胞的抑制作用

目的:构建一种重组腺病毒rAdCDES,在体内外进行抑瘤和放疗增敏作用实验研究.方法:用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES.用测定生长曲线和MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长抑制情况;建立津白号鼠乳腺癌模型,观察rAdCDES和放疗对瘤体大小及鼠存活期的影响.结果:成功构建了rAdCDES;rAdCDES对MCF-7细胞生长抑制率达(83.1±8.1)%,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P＜0.01);体内rAdCDES对小鼠乳腺癌MA737细胞有明显生长抑制作用,延长了小鼠的存活期,且对放疗有肯定的增敏作用.结论:本文所构建的rAdCDES在体内外对乳腺癌细胞均有明显的抑制作用和对放疗的增敏作用.     

高效化学转化菌内同源重组法构建重组腺病毒

目的：对细菌内同源重组法构建重组腺病毒AdEasy系统加以改进，为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。方法：将自杀基因CD和HSV—TK插入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，Pme I酶切后，用酚：氯仿抽提、乙醇沉淀或切胶回收纯化；分别采用电穿孔转化法和化学转化法将线性穿梭质粒(pAdTrackCMV-CDglyTK)与腺病毒骨架质粒pAdEasy—1在细菌内实现同源重组；将重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP-CDglyTK以脂质体介导至293细胞中进行包装、扩增。结果：采用切胶回收化学转化法获得阳性重组率最高(100％)。经PCR、酶切以及测序等方法鉴定，证实融合自杀基因已成功插入腺病毒中。结论：对细菌内同源重组法构建重组腺病毒的方法进行了改进，在降低实验成本的同时获得了较原法更高的阳性重组率，并成功构建了复制缺陷性重组腺病毒rAd-CDglyTK。     

胸膜肺厌氧菌感染

胸膜肺感染是指胸膜腔和肺的感染,是胸部最常见的感染性疾病之一。由厌氧菌引起的胸膜肺感染主要包括肺炎(急性或慢性),坏死性肺炎,肺脓肿,感染性肺梗塞及脓胸等。现就厌氧菌胸膜肺感染的病原学诊断及抗生素治疗等几个问题加以综     

肺结核病人血清β_2微球蛋白

本文旨在评价急性肺结核病人及结核病痊愈2年后的个体血清中β_2微球蛋白(β_2-M)的水平。实验组包括39例严重活动性肺结核病人(抗酸染色及结核菌培养均为阳性)及19例肺结核恢复者(症状完全消失2年),并以50例正常人作为对照组。用微量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了各组血清β_2-M 水平。结果表明,所有活动性肺结核病人血清β_2-M 值均升高,均值为6.308±1.188μg/ml,与对照组(均