快速老化痴呆模型小鼠SAMP8学习记忆能力的增龄性变化

目的对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8学习记忆能力的增龄性变化进行较系统的研究,为利用该模型进行其他研究提供实验依据。方法此实验选用1、4、8、12月龄的快速老化痴呆模型小鼠SAMP8,与同龄的正常老化小鼠SAMR1作对照,从老化度评分、避暗实验、Morris水迷宫实验和自主活动实验等方面观察了SAMP8小鼠学习记忆能力的增龄性变化。结果与对照组SAMR1相比,SAMP8小鼠随月龄增加老化度评分呈增高趋势,在8、12月龄的老化度评分值显著高于同龄对照组(P<0.05);避暗实验中,8、12月龄的SAMP8小鼠在电击24h后进入暗箱的潜伏期比同龄SAMR1小鼠显著缩短(P<0.05);Morris水迷宫实验中,1、4月龄SAMP8小鼠找到暗台的潜伏时间与同龄SAMR1小鼠相比差异无显著性,而8、12月龄SAMP8小鼠与同龄对照组相比,潜伏时间显著延长(P<0.05);从自主活动实验看,1、4、8月龄SAMP8小鼠单位时间内自主活动次数与同龄SAMR1小鼠相比无显著变化,而12月龄SAMP8小鼠与同龄对照组相比单位时间内自主活动次数显著减少(P<0.05)。结论SAMP8小鼠随月龄增长学习记忆能力逐渐减退;与同龄对照组相比,8、12月龄SAMP8小鼠出现明显衰老特征,表现出学习记忆能力明显低下,故可作为老化痴呆的动物模型用于痴呆有关研究。     

结直肠癌淋巴结转移与APC、p53和K-ras基因变异的相关性研究

目的探讨结直肠癌淋巴结转移与APC、p53和K-ras基因变异的相关性。方法用组织DNA抽提试剂盒提取32例淋巴结转移和20例无淋巴结转移的结直肠癌组织DNA,用DHPLC法对APC基因第15号外显子突变富集区(mutation clus-ter region,MCR)和p53基因的第4～9外显子进行基因变异初筛,对K-ras第12、13和61密码子采用PCR产物直接测序进行基因变异初筛,并用基因克隆测序法进行各变异位点确认。结果 APC基因在淋巴结转移患者癌组织中的突变频率显著高于无淋巴结转移患者(53.1%vs 15.0%P=0.006),在Ⅲ和Ⅳ期患者癌组织中突变频率显著高于Ⅰ和Ⅱ期患者(60.0%vs 10.5%,P=0.001),在肝转移患者癌组织中的突变频率显著高于无肝转移患者(85.7%vs 31.1%,P=0.006)。结论本研究结果显示APC基因MCR的基因变异可能是结直肠癌淋巴结转移的重要生物标志,也可能是临床分级及肝转移的重要生物标志。     

半嵌套式RT-PCR法检测肾病患者尿沉渣中WT1基因表达研究

目的探讨尿沉渣中WT1基因表达在肾脏病检测中的意义。方法采用半嵌套式RT—PCR方法检测健康人，慢性肾小球肾炎(CGN)，风湿性疾病以及糖尿病肾病等进行性肾损害患者尿中WT1基因表达情况。结果在尿蛋白阳性的CGN和DM患者，尿沉渣中WT1表达阳性率分别为46.7％(14／30)和44．4％(16／36)；在尿蛋白阴性的DM患者，尿沉渣中WT1基因表达阳性率5.95%(5／84)；在风湿性疾病患者，尿沉渣中WT1基因表达阳性率为16．0％(4／25)；WT1基因表达与蛋白尿阳性程度，血尿，肾功能及临床病程无关；正常人，多囊肾以及慢性膀胱炎患者，尿沉渣中WT1基因表达均为阴性。结论尿中WT1基因检测对进行性肾脏损害的早期诊断具有十分重要的意义。     

KIF5B过表达和干扰慢病毒载体的构建及对结直肠癌细胞增殖的影响

目的 构建马达蛋白KIF5B基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步构建稳定转染结直肠癌细胞模型,检测敲低KIF5B蛋白对结直肠癌细胞增殖的影响。方法 将PCR扩增的人KIF5B基因序列和设计合成的shRNA序列分别插入GV-358和GV-248表达载体。采用慢病毒三质粒包装系统共转染HEK293T细胞,进行病毒包装和扩增。重组慢病毒感染结直肠癌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot法检测KIF5B过表达和沉默效率。CCK-8检测KIF5B干扰后HCT116和SW480细胞的增殖,并检测细胞内周期相关蛋白的表达。结果 KIF5B过表达及shRNA载体测序与原设计序列完全符合。重组病毒感染结直肠癌细胞中,可见绿色荧光蛋白表达。KIF5B过表达组细胞中KIF5B-FLAG蛋白大量表达,KIF5B沉默细胞中,KIF5B的蛋白表达量显著下降。KIF5B被敲低后,HCT116和SW480细胞增殖加快,细胞内p21、p16两种蛋白表达下调。结论 成功建立了KIF5B过表达和沉默的结直肠癌细胞模型,并且发现KIF5B表达被干扰后,可能会抑制p21与p16蛋白的表达,加速细胞周期,从而促进结直肠癌细胞增殖。     

ID-LC-MS/MS方法对高糖血症SD大鼠肾组织DNA中8-oxo-dGsn的检测

目的 用同位素稀释高效液相-串联质谱法（Isotope-Diluted LC-MS/MS,ID-LC-MS/MS）和免疫组化法检测高糖血症SD大鼠肾组织DNA氧化产物8-羟基脱氧鸟苷（8-oxo-dGsn）的含量,评价高糖血症对大鼠肾组织DNA氧化损伤的影响.方法 健康雄性SD（Sprague-Dawley rats）大鼠28只,随机分为4组：3月糖尿病模型组（3DR组）及其对照组（3CR组）,6月糖尿病模型组（6DR组）及其对照组（6CR组）.糖尿病模型组接受腹腔单次链脲佐菌素（streptozotosin,STZ）每公斤70mg注射,对照组接受腹腔生理盐水注射.糖尿病模型组造模成功3个月及6个月后,分别抽提大鼠肾组织DNA,用ID-LC-MS/MS方法检测其DNA氧化产物8-oxo-dGsn的含量;用免疫组化法观察肾组织中DNA氧化损伤部位及程度.结果 糖尿病模型组造模成功3个月时肾组织DNA中8-oxo-dGsn高于对照组高,造模成功6个月时肾组织DNA中8-oxodGsn含量比正常对照组增加显著（P＜0.01）;免疫组化结果显示3个月模型组DNA氧化损伤水平高于对照组,6个月时模型组DNA氧化损伤更为严重.结论 高糖血症3个月可造成大鼠肾组织DNA的氧化损伤,高糖血症6个月时大鼠肾组织中DNA氧化损伤程度呈显著增加,高糖血症是肾组织中DNA氧化损伤的重要原因.     

肌细胞增强因子2A CAG重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性研究

目的构建肌细胞增强因子2A(MEF2A)/绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,检测其在Hela和293T细胞中的表达,探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性。方法用PCR法扩增野生型MEF2A基因全长cDNA序列,以及其他含4～15个CAG三联核苷酸重复序列的变异型MEF2A全长cDNA序列;将上述12种MEF2A全长cDNA序列分别克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体pEGFP-Cl,构建MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A、变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-CAGr;通过脂质体介导的方法将以上质粒转染到Hela和293T细胞,荧光显微镜检测GFP蛋白的表达。结果构建成功与GFP融合的野生型及变异型MEF2A蛋白表达质粒共12种用于细胞学定位功能研究,体外实验结果显示,上述12种MEF2A蛋白均定位于细胞核内。结论 MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变不会影响其细胞内的定位功能。     

MEF2A基因21碱基特异性缺失突变的检测及其临床意义的探讨

本研究旨在检测中国汉族人群MEF（myocyte enhance factor）2A基因第11号外显子区21-bp的特异性缺失突变，并分析其临床意义。     

评价一种新CYP2C9突变型对药物代谢的影响

目的 在体外表达细胞色素P2C9(32T>C),构建酶促反应体系,检测其对甲苯磺丁脲(tolbutamide)的代谢活性。方法 利用定向诱变技术,以细胞色素P2C9野生型的互补DNA为反义链,获得细胞色素P2C9*3以及细胞色素P2C9(32T>C)的complementary DNA,利用杆状病毒穿梭载体bacmid抽提试剂盒获得bacmid,转染伪黏虫卵巢细胞,充分表达后提取微粒体蛋白质,并用免疫印迹法检测其表达量。在体外条件下,测定各型细胞色素P2C9催化甲苯磺丁脲代谢的最大反应速率V_m和米氏常数K_m,评价新突变体的催化功能。 结果 利用昆虫表达系统表达获得细胞色素P2C9*1、细胞色素P2C9*3和细胞色素P2C9(32T>C)3种微粒体蛋白质。免疫印迹结果显示,新变异型蛋白表达水平接近于野生型。体外代谢实验结果显示,细胞色素P2C9(32T>C) 针对甲苯磺丁脲的体外清除率(V_m/K_m)明显低于野生型,体外酶学活性为野生型的12.40%。结论 在体外条件下,细胞色素P2C9(32T>C)对甲苯磺丁脲的代谢活性明显下降,提示携带有该基因型的患者服用细胞色素P2C9的底物药时,体内代谢速率可能会有不同程度的降低,用药前需考虑调整剂量。