端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验

背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.ChantalAutexier馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达)。主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果。②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果。结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异。②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性。③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性。④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常。⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强。结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。     

骨髓间质干细胞分离培养及向心肌细胞的转化

目的:探讨骨髓间质干细胞(MsCs)诱导分化为心肌细胞的可能性,为干细胞移植治疗心肌梗死寻求理想的细胞材料.方法:体外分离培养大鼠骨髓MSCs,5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h后继续培养,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测心肌细胞特异性蛋白的表达.结果:MSCs经5-aza诱导后3周心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43免疫细胞化学染色阳性表达;RT-PCR显示诱导3周细胞有心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白表达.结论:MsCs可在体外经5-aza诱导定向分化为心肌细胞.     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间质干细胞基因转移研究

目的：构建hTERT-逆转录病毒载体，向脐血间质干细胞（MSCs）中导入hTERT基因，观察该基因对细胞端粒酶活性的影响，能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法: PCR法扩增出hTERT全部片段，定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内，筛选阳性产毒细胞，测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs，筛选转基因细胞。检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达，端粒酶活性的变化，hTERT转入后对细胞增殖的影响。用5-氮杂胞苷将转基因细胞向心肌方向诱导，检测心肌特异抗体的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒，证明PLNCX2-hTERT构建成功，转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达，细胞端粒酶阳性。生长曲线显示转基因细胞增殖速度快于未转染细胞。向心肌细胞诱导后，心肌特异性抗体 α-sarcomeric actin和connexin-43均有表达。结论:在逆转录病毒介导下，外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达，激活细胞端粒酶的活性，有效延长了细胞的寿命，不影响其分化功能。     

医院内个人藏书管理系统的设计与开发

目的为了扩大医院图书馆文献资料的收集范围,提高科技文献资料的利用率.方法采用PB7.0 VC 6.0做为前台开发,后台使用Sybase SQL Any Where数据库管理系统建立数据库.结果开发出具有界面清新,操作简便灵活,处理速度快,功能全面的藏书管理系统.结论系统测试,数据准确.结果符合图书管理的业务需求,系统运行安全可靠.     

医院图书馆信息资源管理策略

本文阐述了医院从传统图书馆到数字图书馆不同时期所产生的不同载体形式的信息资源,以不同的管理方式和管理技术进行科学、合理、有效的组织和利用,使图书馆信息资源发挥巨大潜能,从而服务于医院的各项工作.     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达

目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达。方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达。结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达。     

腰椎椎体后缘软骨结节的影像学诊断

目的：总结腰椎椎体后缘软骨结节所致腰椎管狭窄症的临床、影像学表现及诊断要点．探讨有关的发病因素。方法：对32例腰椎椎体后缘软骨结节所致腰椎管狭窄症的临床表现、影像学特征进行分析。结果：32例均有间歇性跛行，多以腰腿痛为主诉就诊，9例推拿按摩后症状加重。X线腰椎侧位片见病变椎体（以腰4、5为主）后下（或上）角有骨缺损及该区有游离小骨块突入椎管内；典型的影像学改变为：（1）椎体后上缘类圆形骨质缺损，边缘较致密硬化；（2）缺损后方有一骨块突入椎管（游离或部分与椎体相连）；（3）硬膜囊及神经根受压，可伴有椎间盘突出。结论：CT有特征性表现，能为制订治疗方案提供可靠依据。     

论医院信息资源的开发和利用

二十一世纪 ,是以知识经济为主导的信息时代 ,日新月异的信息技术正从根本上改变着我们的工作、学习和生活。随着西部大开发的到来 ,卫生改革的不断深化 ,医院如何顺应时代潮流 ,迎接新的挑战 ,信息资源的开发和利用显得至关重要。1　解放思想 ,更新观念提高对信息管理工作重要性的认识 ,是合理开发和有效利用信息资源的先决条件。医院的信息资源是医院宏观管理和科学决策的依据 ,信息资源开发和利用的多少 ,是强化医院管理 ,促进自我生存与发展的重要因素。做为医院信息科 ,由于它的工作性质是一项只有投资而看不到直接经济效益的工作 ,如…     

血流动力学新特点与冠状动脉粥样硬化发生的关系

动脉粥样硬化(atheroscleorsis,AS)最早的改变为血管内皮细胞功能异常.作用于血管内皮细胞的力有2种:流体对管壁的剪应力(wall shear stress,WSS),是由血流驱动的；而固体周围牵张力(circumferential strain,CS)和相关的周围应力则是由血压驱动引起的.这2种力同时作...     

肿瘤相关抗原及其抗体检测在恶性肿瘤诊断中的应用

多数恶性肿瘤患者确诊时已发展至中晚期,治疗措施及效果有限,是导致恶性肿瘤患者高死亡率的根本原因之一。然而,早期诊断和治疗能够明显提高恶性肿瘤患者的治愈率,降低死亡率,延长患者生存时间。因此,近年来的研究热点之一是寻找恶性肿瘤早期诊断的生物标志物,以便早期发现,彻底治愈[1]。