人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究

目的：以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18（hIL-18）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）融合基因，并观察其生物学功能。方法：健康人单核细胞经RT～PCR扩增hIL-18后、T—A克隆。亚克隆至经NheⅠ、HindⅢ酶切的PCDNA3．1（＋）／hTERT中，限制性内切酶验证后，挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT／hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T3细胞中表达，经Western—blot验证目的基因表达产物，同时对转染细胞作免疫荧光染色。以ELISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌了干扰素的能力，以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果：hTERT／hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA3．1（＋）构建成功，经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析，该基因片段与NCBI基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99．9％；而细胞转染后经Western—blot验证，hTERT／hIL-18融合蛋白的分子量约127kMr，与预期一致，荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素，并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论：本实验构建的PCDNA3．1（＋）／hTERT—hIL-18质粒能够在真核细胞中表达，并具有生物学功能，为进一步转染树突状细胞，研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。     

类风湿性关节炎患者血清和滑液IL-18及IL-18结合蛋白的水平及意义

目的研究类风湿性关节炎(RA)患者血清、滑液中白细胞介素-18(IL-18)及IL-18结合蛋白(IL-18BP)的水平，探讨他们在RA致病中的作用。方法应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)和生物学方法分别测定RA患者血清、滑液中IL-18及IL-18BP水平和生物活性，同时采用硝酸酶还原法及竞争ELISA分别检测一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的含量。以因外伤截肢者作对照。结果RA患者血清、滑液中IL-18水平和生物活性均显著高于对照组，且滑液中量及活性比血清中高；而IL-18BP水平RA患者明显低于对照组。结论IL-18的过度表达以及IL-18BP表达的相对不足，可能是RA发病的机制之一；选择抑制过度表达的IL-18生物活性，及增加IL-18BP的表达，将是RA治疗的新途径。     

原发性肝癌患者血清hcct-19特异性抗体的研究

目的探讨hcct-19抗原对HCC的特异性。方法采用重组cDNA表达文库血清学分析技术(SEREX)研究异体HCC和其他疾病患者血清hcct-19抗体的阳性率,并用χ2检验分析HCC患者血清中hcct-19抗体阳性表达与患者临床指标之间的关系。结果 hcct-19抗体的产生主要见于HCC患者,阳性反应率为27/46(58.70%)。正常健康人、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者、胃癌患者、胰腺癌患者及大肠癌患者阳性反应率分别为0.00%(0/20)、0.00%(0/20)、0.05%(1/20)、8.33%(1/12)、0.00%(0/9)及0.00%(0/11)。HCC患者血清中hcct-19抗体的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度、血清AFP水平、HBV感染及是否合并肝硬化无显著的相关性(P>0.05)。结论 hcct-19抗原对HCC有高度特异性,可考虑作为HCC血清学诊断的指标之一。     

人原发性肝癌组织cDNA文库的构建及鉴定

目的构建人原发性肝癌组织cDNA文库,筛查与原发性肝癌发生特异相关的基因,为探讨原发性肝癌的发病机制及基因治疗奠定基础。方法提取人原发性肝癌组织总RNA并纯化其mRNA;逆转录合成单链cDNA,长距离聚合酶链反应(PCR)合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解并纯化后,进行SfiⅠ酶酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的组分,并与λTriplEx2载体连接;将连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;检测扩增后文库的滴度和重组效率,随机挑取14个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果未扩增文库的滴度为1.37×106pfu/ml,重组效率为97.46%;扩增后文库滴度为1.28×109pfu/ml,重组效率为99.06%;插入片段平均长度为0.95 kb,长度在1.0~2.0 kb的4个,0.75~1.0 kb的4个,0.5~0.75 kb的6个。结论已成功构建一个乙型肝炎肝硬化基础上发生的人原发性肝癌组织cDNA文库。     

金钠多对脂多糖所致急性肺损伤大鼠的保护作用

目的研究金钠多对脂多糖(LPS)所致急性肺损伤(ALI)的保护机制及治疗作用。方法采用尾静脉注射脂多糖,按5 mg/kg剂量注射,复制急性肺损伤大鼠模型。将63只Wistar品系大鼠随机分成3组,分别为空白对照组、脂多糖损伤组、金钠多治疗组。各组再随机分为3组,分别为尾静脉注射后2 h、6 h和10 h。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中可溶性ICAM-1(sICAM-1)水平,肺组织标本分别用免疫组化(定性)和蛋白印迹(定量)方法检测其NFkB核因子。结果尾静脉注射脂多糖可成功复制出急性肺损伤大鼠模型；治疗组血清sICAM-1水平明显高于空白对照组(P＜0．01),损伤组的血清sICAM-1水平明显高于治疗组和空白对照组(P＜0．01)；免疫组化和蛋白印迹实验证实,NF-kB核因子在各组中的阳性表达强度为：金钠多损伤组＞脂多糖治疗组＞空白对照组(P＜0．01)。结论脂多糖可诱导急性肺损伤,金钠多对脂多糖所致的急性肺损伤具有显著的保护作用,其机制可能是抑制了肺组织细胞NF-kB的活性。     

重组β-防御素2在脓毒症所致大鼠急性肺损伤发生发展中的作用

目的：探讨重组β-防御素2（BD2）对脓毒症所致大鼠急性肺损伤的保护作用以及对预后的改善。方法：SD大鼠36只随机分为对照组及实验组，每组各18只，分别予以气管滴注对照腺病毒载体（Ad-V，10^7PFU／ml）及可表达大鼠β-防御素2（rBD2）的腺病毒载体（Ad-rBD2，10^7PFU／m1）各100μl。48h后行盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型；复制此模型后36h处死大鼠（n=12，实验组、对照组各6只），行腹腔灌洗液细菌计数、肺组织常规病理切片观察以及大鼠生存率分析（n=24，Ad-V组、Ad-rBD2组各12只）。结果：与对照组（Ad-V组）比较，实验组（Ad-rBD2组）肺组织损伤程度减轻，生存率明显提高（P〈0．05），腹腔灌洗液细菌计数无明显差别。结论：在体内表达的重组β-防御素2可明显改善脓毒症所致的急性肺损伤的肺部病变及其预后。     

高生物活性复合人工骨修复骨缺损的实验研究

目的：探讨载有转化生长因子β1（TGF－β1），具有高生物活性复合人工骨修复骨缺损的价值。方法：建立SD大鼠下颌骨缺损模型。采用组织学和分子生物学Slot Blot杂交法，检测羟基磷灰石复合TGF－β1实验组，单纯羟基磷灰石对照组，无材料修复的空白对照组在骨缺损愈合过程中的组织学及Ⅰ型胶原mRNA的表达状况。结果：实验组的新骨形成及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平最高。结论：提示栽有TGF－β1的高生物活性复合人工骨局部使用能促进骨愈合。     

慢性乙型肝炎及肝硬化患者外周血中TNF-α活性及其受体水平变化

检测部分慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化患者外周血TNF-α及其受体的水平,显示PBMC8 TNF-α诱生能力明显降低,而sTNFR-Ⅰ和sTNFR-Ⅱ均明显升高。其机制可能是患者PBMCs膜TNF受体表达增多,结合了诱导产生的TNF-α,使其诱生能力下降,也提示血清sTNFR水平在一定程度上反映了慢性肝炎的严重程度。     

鳖甲抗肝纤维化活性物质的筛选与分离鉴定

目的 筛选鳖甲抗肝纤维化的活性物质,并对其进行分离鉴定.方法 在生物化学与药理学跟踪技术下,通过膜分离技术筛选鳖甲抗肝纤维化的活性部位;采用凝胶色谱柱分离法在活性部位筛选活性组分;应用高效液相色谱分离法对活性组分进行分离纯化;通过4700串联飞行时间质谱仪对鳖甲活性纯化组分进行结构鉴定.对数据进行方差分析和组间q检验. 结果筛选出鳖甲蛋白质和肽类的分子量＜6000的物质具有生物学活性,从而确定了鳖甲抗肝纤维化的活性部位.将活性部位分离为8个组分(Bjl～Bj8),筛选出Bj4、Bj6和Bj7三个活性组分.对活性组分Bj7进行分离纯化,得到7个纯化组分(Bj701～Bj707);经筛选得出Bj704和Bj707的生物学活性较为显著.通过4700串联飞行时间质谱仪对Bj707纯化组分Bj707-A进行测试,选择质/荷比为526、542和572三个丰度最强的分子离子峰,用De Novo Explorer分析软件进行分析,测出该3个肽类化合物的氨基酸序列分别为NDDY(Asn-Asp-Asp-Tvr)、NPNPT(Asn-Pro-Asn-Pro-Thr)、HGRFG(His-Gly-Arg-Phe-Gly);根据分子离子峰的丰度判断,M572的肽类化合物含量最高.结论 应用学科交叉的研究方法,提取分离并鉴定了鳖甲抗肝纤维化的3个活性肽类物质,为鳖甲用于临床抗肝纤维化、新药开发奠定了基础.     

类风湿关节炎患者血清及关节滑液RANTES和MCP-1的表达水平及其临床意义

目的研究类风湿关节炎(RA)患者血清、关节滑液中调节活化正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达水平,探讨它们在RA病理过程中的作用。方法用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定38例类风湿关节炎患者血清及病变膝关节滑液中RANTES、MCP-1和C反应蛋白的水平,并与骨关节炎(OA组)和外伤截肢者(对照组)对照。结果RA患者血清及滑液中RANTES、MCP-1表达水平明显高于OA组及对照组,且滑液中的水平也显著高于血清水平。RANTES、MCP-1的表达与C反应蛋白的水平呈正相关。结论RA患者过度表达的RANTES、MCP-1参与了RA的炎症及关节病变的病理过程。