基于大量质粒序列研究耐药基因与重金属抗性基因共分布

目的:抗生素或重金属通过共选择机制促进携带耐药基因(ARG)和重金属抗性基因(MRG)的质粒在细菌中传播与扩散是形成耐药的重要因素,本研究通过已测序的大量质粒基因组数据分析ARGs和MRGs的共分布规律。方法:对已测序的17 387个细菌质粒基因组序列中的ARGs和MRGs进行重注释,并采用物理距离深度评估ARGs和MRGs之间的共分布关系。结果:6.7%质粒(1178个)同时携带ARGs和MRGs,携带的抗性基因数分别占ARGs总数的47.2%(7026/14882)和MRGs总数的57.5%(9856/17144);主要的ARGs为氨基糖苷、β-内酰胺和磺胺,主要的MRGs为汞、银、铜和砷;不同种类的MRG最近的ARG谱具有偏好性;与植物宿主质粒比较,来源于人类、动物和污染的环境宿主的质粒具有更高的ARG和MRG共分布频率,并且ARG和MRG之间的物理距离更短。结论:本研究结果对进一步认识通过质粒介导的ARG和MRG共转移导致耐药性而引发的健康风险具有重要意义。     

体外转染Cyclin A2基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响

目的探讨体外转染细胞周期素A2(Cyclin A2)基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法 SD乳鼠12只,分离、培养、鉴定原代乳鼠心肌细胞并分为3组,实验组:转染带有强化绿色荧光蛋白(GFP)和Cyclin A2基因的重组腺病毒(Ad-Cyclin A2-GFP);空病毒组:转染不含目的基因带有GFP的重组腺病毒(Ad-Null-GFP);阴性对照组:未做转染处理,仅加入等量的培养基。利用GFP示踪技术,评估原代心肌细胞转染效率;转染后的细胞继续体外培养3~5d,利用免疫荧光技术分别检测Cyclin A2、磷酸化组蛋白H3(H3P)、心肌肌钙蛋白-T(c Tn T)。结果 1.荧光GFP示踪表明原代心肌细胞的转染效率高达(97±0.74)%;2.免疫荧光标记显示,空病毒组和对照组结果相似;心肌细胞特异性标记蛋白c Tn T分布于细胞质,原代心肌细胞纯度高达(95±0.62)%;心肌细胞Cyclin A2主要在胞核内聚集,少数分布于细胞质。H3P为核蛋白在细胞核内分布。3.转染Cyclin A2后,实验组H3P阳性率明显高于空病毒组和对照组,差异具有统计学意义(P0.05);实验组可见大量多核细胞,以双核为主,伴少量3核细胞。结论腺病毒作为转染载体对原代心肌细胞有很好的侵染效率;Cyclin A2超表达促进原代心肌细胞形成双核。     

微小RNA-1266对钠通道蛋白表达和分布的影响

目的探讨心房颤动(AF)相关微小RNA-1266-5p(miR-1266-5p)与AF相关钠离子通道蛋白α亚基编码基因SCNA5的靶向调控关系。方法构建含有预测结合位点3'非翻译区(3'UTR)序列的靶基因,将其与阴性对照质粒以及miRNA共转染入人胚肾HEK293细胞,实验分为空白对照组、阴性对照组、实验一组(pc DNA3. 1-SCN5A 3'UTR改建质粒+miR-1266)和实验二组(pc DNA3. 1-SCN5A WT质粒,不含3'UTR端+miR-1266),荧光定量PCR法和Western blot法检测各组钠通道蛋白SCN5A mRNA和Nav1. 5蛋白表达变化,免疫荧光实验观察SCN5A Nav1. 5蛋白表达和分布变化。结果与空白对照组和阴性对照组比较,实验一组SCN5A mRNA表达分别下调49. 4%和46. 0%,差异有统计学意义(0. 557±0. 016 vs 1. 101±0. 132和1. 031±0. 020,P 0. 05),而实验二组SCN5A mRNA表达无显著变化(P 0. 05);实验一组SCN5A Nav1. 5蛋白表达下降,而实验二组SCN5A Nav1. 5蛋白表达无显著变化;实验一组和实验二组的SCN5A Nav1. 5蛋白分布都无显著变化。结论 SCN5A可能是miR-1266的直接靶基因,miR-1266可能通过负性调控SCN5A表达参与AF电重构。     

受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ转基因载体的构建及其在细胞水平上的有效性检测

目的：构建一种可以在哺乳动物细胞中蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的受控型转基因载体，为制备受控型蜕皮激素诱导表达截短型MGF-Ⅰ的转基因小鼠奠定基础。方法：利用分子克隆技术构建受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的转基因载体；将其电转至AM1菌中，利用其中的Cre重组酶将载体上两个同向LoxP序更锚定的新霉素（neomycin）基因删除，解除其对蜕皮激素诱导表达系统的阻断作用，利用PCR、酶切和测序鉴定删除情况；将重组后的载体转染至COS7细胞中进行瞬间表达，蜕皮激素诱导后回收培养上清和细胞裂解物进行Western印迹分析，检测hIGF-Ⅰ的表达情况。结果和结论：成功构建大小为13．6kb的转基因载体pOE-IGF-Ⅰ；转化至AM1中后，PCR、酶切和测序的结果都证明其中的Cre酶能够将载体上neomycin基因删除；重组后的载体转染至COS7细胞中进行诱导表达，Western印迹实验证明截短型MGF-Ⅰ能够在COS7细胞中顺利表达。上述结果证明该蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的受控型转基因载体能够用于转基因小鼠的制备。     

涎腺疾病

20062419脂质体介导nm23-h1质粒体内转染腺样囊性癌可行性；20062420腮腺切除改良术式治疗腮腺良性肿瘤；20062421内镜辅助下慢性阻塞性腮腺炎的病因分析；20062422核因子KB与涎腺腺样囊性癌微血管密度、临床病理及预后的关系；20062423唾液腺腺样囊性癌FAK和PTEN蛋白的表达及意义；20062424CT灌注诊断腮腺肿瘤的临床价值评价。[编者按]     

体外转染SV40的鼠内皮细胞生长特性的研究

体外培养的内皮细胞具有血清和生长因子的依赖性，且具有异质性，用其进行体外研究血管生成结果难以分析。本实验拟用SV40转染鼠内皮细胞，为体外研究血管生成提供稳定内皮细胞株。     

重组腺相关病毒-阳离子脂质体载体的构建及评价

目的探讨重组腺病毒相关病毒（rAAV）-阳离子脂质体（LyoVec）复合载体的构建方法及其转染率评价。方法构建rAAv～GFP，rAAv—LyoVec复合载体及rAAV—GFP—LyoVec。倒置荧光显微镜观察，测定rAAV—GFP，LyoVec—GFP及rAAV—GFP-LyroVec对定量C6细胞的转染率，筛选出高转染率载体。结果rAAV—GFP组24、48、72和96h转染率分别为16％、23％、21％和9％；LyoVec-GFP组为28．5％、33％、32％和11％；rAAV—GFP—Lyovec组为49％、59％、64％和20％。rAAV-GFP—LyoVec纽分别在24、48、72和96h的转染率显著高于rAAV—GFP组（P〈0．01）及LyoVec—GFP组（P〈0．01）。结论新构建rAAV—LyoVec复合载体基因的转染效率远远高于rAAV或LyoVec独立转染。     

血小板源性内皮细胞生长因子小干扰RNA质粒的构建和鉴定

目的构建针对血小板源性血管内皮生长因子（PDECGF）小干扰RNA（siRNA）表达质粒和阴性对照质粒pIASRC-PDECGF，并观察对PDECGF表达的影响。方法构建针对PDECGFsiRNA表达质粒pIASR-PDECGF和阴性对照质粒pIASRC—PDECGF，将沟建成功的质粒转染大肠癌细胞株GC7901，观察PDECGF蛋白表达的影响。结果成功构建针对PDECGF siRNA表达质粒pIASR-PDECGF。并发现它能够明显抑制PDECGF的表达。而阴性对照质粒则无此作用。结论血小板源性内皮细胞生长因子小干扰RNA能够特异性抑制PDECGF的表达。