体外转染Cyclin A2基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响

目的探讨体外转染细胞周期素A2(Cyclin A2)基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法 SD乳鼠12只,分离、培养、鉴定原代乳鼠心肌细胞并分为3组,实验组:转染带有强化绿色荧光蛋白(GFP)和Cyclin A2基因的重组腺病毒(Ad-Cyclin A2-GFP);空病毒组:转染不含目的基因带有GFP的重组腺病毒(Ad-Null-GFP);阴性对照组:未做转染处理,仅加入等量的培养基。利用GFP示踪技术,评估原代心肌细胞转染效率;转染后的细胞继续体外培养3~5d,利用免疫荧光技术分别检测Cyclin A2、磷酸化组蛋白H3(H3P)、心肌肌钙蛋白-T(c Tn T)。结果 1.荧光GFP示踪表明原代心肌细胞的转染效率高达(97±0.74)%;2.免疫荧光标记显示,空病毒组和对照组结果相似;心肌细胞特异性标记蛋白c Tn T分布于细胞质,原代心肌细胞纯度高达(95±0.62)%;心肌细胞Cyclin A2主要在胞核内聚集,少数分布于细胞质。H3P为核蛋白在细胞核内分布。3.转染Cyclin A2后,实验组H3P阳性率明显高于空病毒组和对照组,差异具有统计学意义(P0.05);实验组可见大量多核细胞,以双核为主,伴少量3核细胞。结论腺病毒作为转染载体对原代心肌细胞有很好的侵染效率;Cyclin A2超表达促进原代心肌细胞形成双核。     

体外培养状态下心肌细胞有丝分裂的证据

目的探讨体外培养状态下心肌细胞有丝分裂、增殖的证据。方法分离新生大鼠心肌细胞,分别原代培养0h至12d;免疫荧光分别双标心肌肌钙蛋白-T(c Tn T)、磷酸化组蛋白H3(H3P)和微管蛋白(tubulin),利用活细胞工作站和荧光显微镜观察处于分裂期的心肌细胞。结果原代培养的心肌细胞生长状态好、纯度高,可观察到分裂各期的心肌细胞及其微管蛋白的变化。处于分裂各期的心肌细胞不隆起变圆仍维持扁平状。分裂前期细胞核形状规则,染色质凝集,H3P开始表达;前中期核膜破裂,纺锤体形成;中期染色体排列在赤道面,纺锤体呈典型纺锤样;后期染色单体分开并移向两极;末期子核形成,平行微管聚结在两子核之间;胞质分裂期形成两个子细胞,两个细胞分开后,可见有少量微管呈丝状连接。原代培养1~12d的心肌细胞在整个细胞分裂图像中很少见到双核心肌细胞。培养第3天开始发现分裂象的心肌细胞,占总心肌细胞数的2/127(1.57%)和1/92(1.09%),培养第7天,分裂细胞比率达3/69(4.35%)和5/163(3.07%),培养第12天有2/100(2%)和0/60(0)的心肌细胞处于分裂期。结论体外培养的心肌细胞存在一定数量的完全有丝分裂,是心肌增殖和心肌再生的细胞学证据。