心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法：构建了心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因载体。该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中，通过胚胎移植，获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Cre重组酶整合情况。通过Northern杂交检测Cre重组酶表达的组织特异性。结果：构建了含有心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体α-MHC—Cre—hGH。将转基因载体进行显微注射，共注射了215枚小鼠受精卵，其中202枚移植入13只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠42只。PCR检测发现有1只小鼠在其基因组上整合有Cre重组酶基因。Northem杂交检测结果显示该转基因小鼠只在心脏组织中特异性地表达Cre重组酶基因。结论：成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

Cre重组酶在软骨组织特异性转基因小鼠中表达的时空分布

目的：检测Cre重组酶在软骨组织特异性Cre重组酶转基因小鼠(Col2al—Cre)表达的时空分布。方法：将Col2al—Cre转基因小鼠和ROSA26报告小鼠杂交，得到的双转基因小鼠中表达Cre重组酶的部位将表达LacZ基因。通过LacZ染色可直接观察不同发育阶段转基因小鼠中Cre重组酶表达的组织特异性。结果：LacZ染色结果显示，骨骼发育早期间充质细胞聚集时Cre重组酶已经在表达Ⅱ型胶原的软骨细胞中行使功能。胚胎期13．5d小鼠的前肢、后肢、脊椎和梅克尔软骨部位LacZ染色阳性。在新生小鼠可见由软骨内成骨形成的骨骼内软骨组织LacZ染色阳性。从新生小鼠的胫骨显微切片可以看到，生长板各区软骨细胞、软骨膜细胞和紧邻生长板干骺端的成骨细胞LacZ染色阳性。结论：我们研制的Col2al-Cre转基因小鼠中Cre重组酶在软骨内成骨过程中所有的软骨细胞中表达，是一种理想的研制软骨组织特异性剔除基因小鼠的工具。     

平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立平滑肌细胞特异表迭Cre重组酶的转基因小鼠。方法：用分子克隆的方法构建含有α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子、Cre重组酶基因和polyA的转基因载体α-SMA-Cre。以显微注射的方法将5．3kb的转基因片段引入小鼠基因组。通过PCR和LacZ染色以检测Cre重组酶在体内介导重组的功能。结果：共注射282枚受精卵，移植至10只假孕母小鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠19只，经PCR鉴定有4只小鼠在基因组上整合有Cre基因，整合率为2l％。将该小鼠与基因组上携带LoxP位点的Smad4务件基因打靶小鼠交配，通过PCR在所有含有平滑肌细胞的组织基因组DNA中检测到重组后的234bp特异条带。与“报告”小鼠-ROSA26交配，LacZ染色后小肠壁平滑肌细胞中特异地检测到Cre重组酶活性。结论：成功构建了平滑肌细胞特异表达Cre重组酶的转基因小鼠．该小鼠在平滑肌细胞中特异表迭Cre重组酶，并能在体内成功地介导LoxP位点间的重组。     

Cre重组酶在心肌细胞特异性转基因小鼠中的功能检测

目的：检测Cre重组酶在心肌细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠（α-MHC-Cre）中的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法：将α-MHC-Cre转基因小鼠与尺DSA26报告小鼠交配，利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。然后，将α-MHC-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配，利用PCR和Southem杂交对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测。结果：LacZ染色表明，Cre重组酶只在心肌细胞中特异性表达并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。PCR和Southem结果显示Cre重组酶只在心肌细胞中特异地剔除了Smad4基因，进一步验证了Cre重组酶在心肌细胞中发挥介导LoxP位点重组的作用。结论：α-MHC-Cre转基因小鼠具有良好的组织特异性，只在心肌细胞中表达Cre重组酶，并能在体内成功地介导心肌细胞基因组上LoxP位点间的重组，是一种理想的研制心肌细胞特异性基因剔除小鼠的工具小鼠。     

东部马脑炎病毒E2基因的表达及DNA免疫的初步研究

目的：构建东部马脑炎病毒E2基因的重组真核表达载体，对其DNA免疫原性进行观察。方法：采用RT-PCR扩增东部马脑炎病毒全长E2基因，构建真核表达载体pcDNA-E2，以脂质体法转染COS7细胞，经蛋白印迹法和免疫荧光法证明E2基因可以表达后，用庐重组质粒DNA免疫Balb/c小鼠，并用免疫荧光法检测鼠血清中病毒的特异抗体。结果：免疫印迹法、免疫荧光法检测表明E2基因在COS7细胞中获得瞬时表达，pcDNA-E2基因免疫小鼠可产生抗东部脑炎病毒的特异抗体。结论：东部马脑炎病毒E2基因的重组质粒DNA可刺激小鼠产生特异性的抗东部马脑炎病毒体液免疫应答，为基因疫苗的研制奠定了基础。     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析

目的：在酵母系统中实现A型肉毒毒素(BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达。方法：将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K，用SacⅠ将重组质粒线性化，电转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞，筛选G418抗性阳性整合子，进行Mut^ 表型株甲醇快速利用诱导。结果：经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化，毒素Hc在pH6．5培养基BMMY中实现稳定的分泌表达，最终筛选到蛋白表达量占上清蛋白10％的分泌高表达株。免疫印迹和酶联免疫检测结果显示，重组BoNTa Hc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性，可以诱导小鼠产生特异性抗体。结论：酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子。     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。     

人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack－CMV－FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ;经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ,使用PEI试剂转染293 A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ;利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ;将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ,并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

炭疽保护性抗原第四结构域基因在重组SFV复制子载体中的表达

目的：构建炭疽毒素保护性抗原第四结构域PA4基因的重组Semliki森林病毒（Semliki forest virus，SFV）复制子载体，并观察PA4抗原在重组SFV复制子载体中的表达。方法：将PA4基因克隆到基于RNA和DNA的SFV复制子表达载体中，获得的重组SFV复制子载体直接转染．BHK21细胞，通过间接免疫荧光和Western印迹试验检测PA4在细胞中的表达；与辅助病毒载体共转染制备重组病毒颗粒，通过间接免疫荧光和Western印迹检测PA4在重组病毒颗粒感染细胞中的表达。结果与结论：成功地构建了基于RNA和DNA的PA4重组SFV复制子载体，并且在体外基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体能够在细胞中有效地表达非分泌型和分泌型的PA4抗原，制备了具有感染能力并能表达PA4抗原的重组病毒颗粒，为进一步以SFV复制子作疫苗载体观察炭疽新型复制子疫苗的免疫原性奠定了基础。     

以Trx为骨架构建可诱导表达的酵母构象型随机肽库

目的:以硫氧还蛋白(Trx)为骨架,pB ridge为载体,构建可诱导表达的酵母构象型随机10肽库。方法:利用PCR扩增出trx基因,向trx的突环区引入AscⅠ酶切位点,构建pB ridge-mTrx重组载体。采用(NNK)10的编码方式设计并合成两条寡核苷酸链,经退火、延伸,AscⅠ,RsrⅡ双酶切后,克隆至pB ridge-mTrx载体,电转化E.coliDH10B感受态细胞。对所构建多肽文库的库容和随机性进行了鉴定,并利用W estern印迹对文库的可诱导性进行分析。结果:获得库容量为8.7×108的随机肽库。随机挑选20个克隆进行测序,4个核苷酸的出现频率与理论值接近。在M et缺陷培养基中,随机肽库可被诱导表达。结论:成功构建可诱导表达的随机肽库,为进一步筛选特异性多肽奠定了基础。     

辐射诱导表达载体pEgr-p16的构建及其体外蛋白表达的研究

目的构建辐射诱导表达载体pEgr—p16并研究其体外稳定转染联合^60Co．γ射线照射对人宫颈癌HeLa细胞p16蛋白表达变化的影响。方法利用双酶切、粘端连接的方法构建了含有辐射诱导特性的早期生长反应因子Egr-1和p16的pEgr—p16的质粒载体，以脂质体介导的方法，将重组载体导入人HeLa细胞，采用免疫细胞化学和流式细胞术的方法检测照射转染后的HeLa细胞p16蛋白表达的变化。结果经全自动测序证明辐射诱导表达载体pEgr—p16构建正确；稳定转染可见有明显的p16表达增强；5Gy以内p16蛋白表达呈剂量依赖性的增加，在2Gy照射后2hp16蛋白表达水平即开始增高，4h达到最高，12h趋于正常水平。结论本研究成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-p16，在HeLa细胞中蛋白表达明显增强。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

pIRES2-EGFP-hBMP2载体在人骨髓基质细胞中的表达及意义

目的：研究人骨形成蛋白hBMP2真核表达载体pIRKS2-EGFP-hBMP2在人骨髓基质细胞系HFCL中的表达及意义。方法：利用DNA重组技术，将hBMP2片段克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中；EeoRI/BamHI双酶切鉴定；脂质体介导的方法转染HFCL．细胞；荧光显微镜下观察转染细胞；免疫组化染色检测hBMP2基因的表达。结果：经酶切鉴定显示，成功地构建了重组载体pIRES2-EGFP-hBMP2。转染HFCL 48h后在荧光显微镜下观察到转染的HFCL细胞发绿色荧光。免疫组化染色显示转染hBMP2基因的HFCL细胞浆内有细的棕色颗粒，而转染空载体的HFCL细胞免疫组化呈阴性。结论：所构建的pIRES2-EGFP-hBMP2真核表达载体在HFCL细胞中有良好的表达，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对放射和化疗所致的造血和骨微环境破坏的改善奠定了基础。     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究