体外转染Cyclin A2基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响

目的探讨体外转染细胞周期素A2(Cyclin A2)基因对原代大鼠心肌细胞增殖的影响,为心脏再生提供细胞学依据。方法 SD乳鼠12只,分离、培养、鉴定原代乳鼠心肌细胞并分为3组,实验组:转染带有强化绿色荧光蛋白(GFP)和Cyclin A2基因的重组腺病毒(Ad-Cyclin A2-GFP);空病毒组:转染不含目的基因带有GFP的重组腺病毒(Ad-Null-GFP);阴性对照组:未做转染处理,仅加入等量的培养基。利用GFP示踪技术,评估原代心肌细胞转染效率;转染后的细胞继续体外培养3~5d,利用免疫荧光技术分别检测Cyclin A2、磷酸化组蛋白H3(H3P)、心肌肌钙蛋白-T(c Tn T)。结果 1.荧光GFP示踪表明原代心肌细胞的转染效率高达(97±0.74)%;2.免疫荧光标记显示,空病毒组和对照组结果相似;心肌细胞特异性标记蛋白c Tn T分布于细胞质,原代心肌细胞纯度高达(95±0.62)%;心肌细胞Cyclin A2主要在胞核内聚集,少数分布于细胞质。H3P为核蛋白在细胞核内分布。3.转染Cyclin A2后,实验组H3P阳性率明显高于空病毒组和对照组,差异具有统计学意义(P0.05);实验组可见大量多核细胞,以双核为主,伴少量3核细胞。结论腺病毒作为转染载体对原代心肌细胞有很好的侵染效率;Cyclin A2超表达促进原代心肌细胞形成双核。     

心脏成纤维细胞生物表型多样性

目的 探讨心脏成纤维细胞（CFs）生物表型多样性。方法 新生1～3天SD大鼠12只,胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新60只生大鼠CFs,比较原代和传代培养细胞形态学变化,免疫组织化学学检测鉴定常见成纤维细胞标记波形蛋白（vimentin）、成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）和盘状结构域受体（DDR2）的表达,细胞免疫荧光检测CFs干细胞标记nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90的表达,细胞免疫荧光三标技术检测CFs干细胞标记间的共表达情况。 结果 酶联合消化法分离培养的CFs收获细胞量大,第3代细胞活力好、纯度高。Vimentin、FSP1和DDR2在CFs中均表达,但DDR2在CFs中呈强表达。部分CFs分别表达nanog、c-kit、sca-1、CD73和CD90,部分nanog阳性的CFs分别和CD73、CD90和sca-1,及其CD90和sca-1存在共表达,nanog⁺ /CD73⁺共表达阳性率最高（59.02%±8.39%）,与其他3组相比差异均有极显著性（P<0.01）;而 nanog⁺ /CD90⁺共表达阳性率与nanog⁺ /sca-1⁺之间差异无显著性（P>0.05）,但这两组与CD90⁺ /sca-1⁺相比差异均有极显著性（P<0.01）;CD90⁺ /sca-1⁺共表达阳性率均低于其他3组,差异具有极显著意义（P<0.01）。 结论 CFs是具有干细胞特征混合细胞群,在表型上具有多样性。     

5-氮杂胞苷诱导大鼠心脏成纤维细胞向心肌样细胞分化进程相关基因的表达差异

目的 探讨5-氮杂胞苷（5-aza）诱导心脏成纤维细胞（CFs）向心肌样细胞分化5 d、7 d、14 d、21 d和28 d相关基因的表达差异。方法 新生1～3 d SD大鼠12只,胰蛋白酶/胶原酶联合消化法分离培养新生大鼠CFs,采用CFs分子标记盘状结构域受体2（DDR2）并行细胞免疫荧光染色。含15 μmol/L 5-aza心肌细胞诱导液培养第3代CFs, Real-time PCR检测心肌化诱导不同时间点相关基因vimentin、DDR2、Nanog、sox2、c-kit、sca-1、Tbx5、CD73、CD34、cMyc、klf4、Gata4、Oct4、Mef2c和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达差异,细胞免疫荧光检测心肌化诱导后5 d、7 d、14 d、21 d和28 d肌钙蛋白T（cTnT）的表达。透射电子显微镜观察心肌化诱导28 d CFs的超微结构变化。结果 5-aza诱导CFs后3 d 细胞生长速率减慢,部分细胞由三角形、梭形向圆形和杆状转变。诱导后7 d、14 d、21 d 和28 d,与诱导前相比,DDR2表达稳定,vimentin在14 d表达下降,Nanog、c-kit、sox2和Tbx5伴随着心肌化进程呈现表达下降趋势,而CD73、Mef2c、CD34、Gata4、Oct4和cTnT表达逐步增加,sca-1在7 d 表达上升又下降,cMyc和klf4在14 d表达上升又下降。诱导后 5 d少量细胞表达cTnT,14～21 d cTnT阳性细胞数明显增高,28 d表达cTnT较多且趋于稳定。透射电子显微镜显示,CFs心肌化诱导28 d,细胞与细胞间出现端-端连接,细胞质内出现大量的肌原纤维,排列较为规律,但肌节不明显,H带、Z线和M线显示不清。结论 CFs经5-aza诱导,可向心肌样细胞分化,但不能形成成熟的心肌细胞。     

开设动物实验改进解剖学实验课教学的实践

人体解剖学是一门古老而经典的形态学科,解剖学实验课是解剖学教学的重要组成部分.实验课的成功与否直接影响教学效果以及学生独立观察能力和思维能力的培养.由于受传统教学理念的影响,解剖学实验课教学模式比较单一,学生在学习过程中很难将组织、器官在尸体和标本上的状态与其活体状态联系起来~[1].     

引入标准化教学模式 提高解剖实验教学质量

<正>人体解剖学是研究人体正常形态结构的科学,是医学生的必修课程,教学形式主要包括理论教学和实验教学。实验课占总学时的60%以上,在教学中占有重要地位,实验教学质量的好坏是学好人体解剖学的关键。为了高质量的完     

大鼠心肌细胞和心肌细胞系H9C2表达弹性蛋白

目的 检测弹性蛋白在大鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞系内的表达。 方法 取新生和成年SD大鼠各5例的新鲜心脏，冷冻切片；取20只新生3 d SD大鼠心脏，通过0.05%胰蛋白酶和0.075%Ⅱ型胶原酶消化法，获取原代心肌细胞；免疫组织化学和免疫荧光技术检测大鼠心肌组织、原代心肌细胞和H9C2心肌细胞系的弹性蛋白表达;ELISA法检测培养的H9C2心肌细胞系上清中的弹性蛋白。 结果 在大鼠心肌细胞、H9C2心肌细胞系和新生、成年大鼠心肌组织上均发现心肌肌钙蛋白T和弹性蛋白的共表达。免疫组织化学结果发现，弹性蛋白在成纤维细胞、平滑肌细胞和细胞间质内均有表达。H9C2心肌细胞培养液的上清中检测到少量的弹性蛋白。 结论 大鼠心肌细胞表达弹性蛋白，可能参与心肌细胞的势能和细胞间质弹性纤维的构建。     

河南地区汉族人群ADAMTS7基因多态性与冠心病相关性分析

目的:研究河南地区汉族人群含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶7(ADAMTS7)基因rs3825807和rs4380028位点单核苷酸多态性(SNP)与冠心病易感性、病变程度间的关系。方法:提取经冠状动脉造影或冠状动脉电子计算机断层扫描成像(CTA)确诊的416例冠心病患者及同期270例健康体检人群的全血基因组DNA,采用PCR扩增测序确定rs3825807和rs4380028位点的基因型,分析单核苷酸多态性与冠心病易感性、冠状动脉病变程度(Gensini评分量化)、颈动脉内膜厚度(超声检测)及其斑块数量间的关系。结果:在rs3825807位点中,等位基因T增加冠心病易感性,即使调整性别、年龄、高血压、吸烟等危险因素后差异仍具有统计学意义;在rs4380028位点中,等位基因G与冠心病易感性无相关性,调整危险因素后差异无统计学意义。rs3825807位点中的等位基因T与Gensini评分、颈动脉内膜厚度呈正相关,与颈动脉斑块数量无相关性;rs4380028等位基因G与Gensini评分、颈动脉内膜厚度无相关性,但与颈动脉斑块数量相关。结论:ADAMTS7的rs3825807等位基因T是冠心病的危险等位基因,增加冠心病易感性,主要是通过使血管内膜增厚影响冠状动脉病变程度;rs4380028等位基因G可能与动脉粥样硬化斑块数量有关,ADAMTS7的SNPs参与冠心病的发生发展。     

新生大鼠心肌telocytes在体外培养状态下的分裂方式

目的 探讨体外培养新生大鼠心肌telocytes的分裂方式。 方法 采用0.1%胶原酶I/0.125%胰蛋白酶联合消化法分离培养新生大鼠心肌telocytes,活细胞工作站动态捕捉和苏木素染色检测telocytes的分裂方式。 结果 酶联合消化法培养新生大鼠心肌telocytes纯度高、活力好,增殖迅速。无丝分裂时,胞核变大,以出芽方式生长,形成哑铃状细胞核,核芽逐渐拉伸并与母细胞分离。有丝分裂前中期,染色质缩短变粗为染色体,整齐地排列在赤道板处;分裂末期,染色体到达两极,子核已初步形成;胞质分裂期,胞质逐步拉开,形成两个子细胞。在有丝分裂不同时期,心肌telocytes均保持其原有的形态特征。 结论 体外培养心肌telocytes增殖时有丝分裂和无丝分裂两种方式并存。     

乳兔窦房结定位、取材及纯化和培养

背景:分离和纯化培养的窦房结细胞是研究其超微结构及自律性的重要条件,然而,相应的培养方法尚未标准化.目的:建立乳兔窦房结进行定位、取材和纯化培养方法,观察并判断培养窦房结细胞中起搏细胞的形态特点.方法:新生24 h内乳兔心脏连续石蜡切片,苏木精-伊红染色,光镜下判断窦房结的位置并测定,计算其大小,光镜、电镜下观察纯化培养的窦房结细胞形态.结果与结论:乳兔窦房结位于上腔静脉根部前壁向下至界沟后外约0.32 mm处.培养的窦房结细胞主要有3种形态细胞:梭形、蜘蛛形、多边形,其中梭形细胞最多,占(59.6±7.3)%,搏动频率最快为(145±9)次/min,肌原纤维稀少,细胞器不发达.蜘蛛形和多边形细胞则和培养的心房肌细胞培养无差异.沿上腔静脉根部前壁向下至界沟后外侧可较精确地对窦房结进行取材.培养的乳兔窦房结细胞中,细胞体积小,搏动频率快,所占比率高的梭形细胞是窦房结的起搏细胞.     

ABI PRISM TM 3100型遗传分析仪最佳反应体系探讨

目的探讨ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的最佳反应体系,使DNA序列测定高效且经济。方法运用含有重组质粒的饱和大肠杆菌E.coli菌液,采取碱裂解法提取质粒。依据测序原理,分别通过调整模板量、BigDye Mix的用量和反应体系的体积来确定ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的最佳反应条件。结果针对该样本,测定DNA序列的最佳反应体系为:模板量100 ng,BigDye Mix 2μL,引物1.6 pmol,双重蒸馏水补足总体积为10μL。结论该反应体系保证了ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的测序质量,且大大节约了成本。