胃大部切除后食管癌,贲门癌的外科治疗

胃大部切除后食管癌、贲门癌的外科治疗赵健１朱长军２王化生１李希波１王树成１彭书华１（１山东医科大学附属医院胸外科２５００１２２泰山医学院）胃大部切除后食管癌、贲门癌比较少见，对其外科治疗的探讨报道不多。我们从１９８４～１９９７年用不同的术式治疗胃大部...     

染色体驱动蛋白KIF4A稳定低表达胃癌细胞系的构建及鉴定

目的 构建稳定低表达染色体驱动蛋白KIF4A的胃癌细胞系,观察KIF4A低表达细胞的有丝分裂期纺锤体中央区的形成.方法 针对人类驱动蛋白KIF4A mRNA的编码区设计特异性siRNA序列,构建KIF4A短发夹RNA（shRNA）表达质粒pGPU-GFP-KIF4A.将质粒转染胃癌细胞SGC-7901,经过G418筛选获得稳定低表达KIF4A的细胞株.使用蛋白免疫印迹方法鉴定细胞株内KIF4A蛋白的敲降效果,并通过细胞免疫荧光染色法观察细胞纺锤体中央区的形成.结果 成功获得了3株不同水平稳定低表达KIF4A的SGC-7901细胞株（SGC-shKIF4A）和稳定表达无意义shRNA的对照细胞（SGC-shNC）;同时,与对照细胞SGC-shNC相比,SGC-shKIF4A细胞中有丝分裂纺锤体中央区延长,并随KIF4A蛋白表达水平的降低而增加.结论 成功构建了不同水平稳定低表达KIF4A蛋白的胃癌细胞SGC-shKIF4A,为进一步研究驱动蛋白分子KIF4A的功能及其在胃癌发生发展过程中的作用奠定基础.     

着丝粒相关蛋白E的抗体制备

目的 制备着丝粒相关蛋白E(CENP-E)的兔源特异性多克隆抗体.方法 应用分子克隆技术构建原核细胞表达质粒pHis-CENPEC410,并将其转化至表达菌株BL-21 (DE3)感受态细胞中;然后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-CENPEC410融合蛋白,再用Ni-NTA镍离子金属螯合树脂柱亲和层析法进行纯化;最后将纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备特异性CENP-E多克隆抗体,分别用免疫印迹法和免疫共沉淀法对免疫抗体血清进行检测,用免疫荧光染色法检测纯化的抗体.结果 制备的抗体血清可较好地应用于免疫印迹和免疫共沉淀实验,纯化的抗体可用于免疫荧光染色.结论 获得了具有较高特异性和灵敏度的CENP-E多克隆抗体,为后续CENP-E蛋白的研究奠定了基础.     

驱动蛋白分子驱动蛋白分子Kif18A各功能域细胞定位的研究驱动蛋白分子Kif18A各功能域细胞定位的研究

目的  探讨人驱动蛋白分子Kif18A的各功能域在真核细胞中的定位。方法  构建驱动蛋白分子Kif18A野生型及各功能域（马达区、杆状区、尾区和马达区含部分杆状区）的绿色荧光蛋白表达质粒,分别转染人乳腺癌细胞MCF7,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法验证各蛋白的表达,免疫荧光染色法分别对细胞进行微管蛋白和DNA染色,荧光显微镜下观察各绿色荧光融合蛋白的具体亚细胞定位。结果  有丝分裂间期,Kif18A蛋白分子的马达区绿色荧光沿微管分布,尾区在细胞核和微管上均有分布,杆状区则散在分布在胞质中;有丝分裂末期,Kif18A的马达区仍沿微管分布,而马达区含部分杆状区主要集中在中体部位。结论  Kif18A蛋白分子的马达区和尾区与微管共定位;尾区含核定位序列;马达区和杆状区共同作用才能使该蛋白在有丝分裂末期定位于中体。     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

抑癌基因p16INK4变异与肿瘤基因治疗

肿瘤抑制基因ｐ１６ＩＮＫ４在肿瘤中的变异及治疗越来越受到重视。本文主要对抑癌基因ｐ１６ＩＮＫ４在肿瘤细胞系与原发性肿瘤中的变异及其在肿瘤基因治疗方面的最新研究进展作一综述。     

沉默驱动蛋白KIF4A的表达对卵巢癌细胞SKOV3迁移的影响

目的  研究沉默KIF4A基因对人卵巢癌SKOV3细胞迁移能力的影响。方法  检索针对KIF4A基因的小干扰RNA（siRNA）,构建shRNA表达质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,通过G418筛选建立稳定低表达KIF4A的SKOV3细胞株。采用蛋白质免疫印记（Western blot）法检测shRNA对KIF4A蛋白分子的敲除效率。并通过细胞迁移实验评价低表达KIF4A对SKOV3细胞迁移能力的影响。结果  成功筛选出稳定低表达KIF4A的细胞株,选择干扰效率较高的细胞株进行实验。Transwell细胞迁移实验显示,低表达KIF4A的细胞株的迁移率较阴性对照组增长近3倍(P＜0.05)。结论   KIF4A低表达,可增强人卵巢癌细胞SKOV3的迁移能力。     

LC-DAD／MS／MS检测石地钱中大环双联苄及其微管抑制活性的细胞筛选

目的：研究苔类植物石地钱中具有微管抑制活性的大环双联苄类化合物。方法：在具有微管抑制活性的石地钱提取部分中,利用LC-DAD／MS／MS方法检测其中的大环双联苄,通过制备高效液相分离和纯化此类化合物、光谱方法鉴定其结构,利用稳定表达EYFP—tubulin的HeLa细胞株考察其抑制微管活性。结果：LC—DAD／MS／MS检测到11个双联苄类化合物,经分离纯化得到其中8个并鉴定为：异地前素C（1）、片叶苔素C（2）、新地前素A（3）、地前素A（4）、异片叶苔素C（5）、片叶苔素B（6）、羽苔素E（7）和地前素C（8）。化合物4和8具有显著的抑制微管解聚活性。结论：化合物3—7均为首次从该植物中分得,并首次报道联苄类化合物具有微管抑制活性。     

抑癌基因P16INK4在sf9细胞中的表达和鉴定

目的利用杆状病毒表达系统在体外表达抑癌蛋白P16,为研究P16蛋白的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定基础.方法①利用定向克隆的方法将P16全基因序列插入转移载体pSX-IVVI+X3的EcoRI、Sall位点上,经氨苄青霉素平板初筛、菌落原位杂交、PCR扩增酶切电泳鉴定后,分离含P16的重组转移载体一pSXIVVI+X3.16;②用昆虫杆状病毒TnNPV-SVI-G感染sf9细胞扩增病毒,用PEG法沉淀病毒、酚/氟仿抽提纯化病毒DNA;③CaCl2沉淀法使重组转移载体一pSXIVVI+X3-16和病毒TnNPV-SVI-G DNA共转染sf9细胞.通过多角体观察和PCR法鉴定重组病毒;④经空斑纯化法纯化重组病毒,重组病毒感染草地夜蛾细胞(sf9)使P16大量表达,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定所表达的P16蛋白.结果①筛选出两株含P16全基因的重组转移载体-pSXIVVI+X3-16;②构建了含P16全基因序列的重组杆状病毒TnNPV-p16;③SDS-PAGE电泳显示重组病毒TnNPV-P16感染sf9细胞的培养上清及胞体裂解物和阳性对照Hela细胞裂解物在16kD左右均有蛋白条带,而阴性对照TnNPV-SVI-G感染的sf9细胞培养上清中无此蛋白条带,经免疫印迹染色证实此蛋白为抑癌蛋白P16.结论利用我国自己构建的昆杆状病毒表达系统成功了表达P16蛋白,分子量大小及特异性与国外报道相同.