肿瘤坏死因子新型免疫抑制剂的构建、表达和鉴定

目的 用鸡卵清溶菌酶(Hen egg-white lysozyme，HEL)T辅助细胞表位序列替换hTNF-α3^ 末端序列，构建和表达hTNF-α新型免疫抑制剂。方法 将重组的hTNF-α HEL克隆、表达、纯化后进行初步的生物学活性鉴定。结果 DNA测序分析表明，重组的hTNF-α HEL3^ 末端序列与设计序列完全相同。将其插入pBV220表达载体中，重组菌经42℃诱导4h做SDS-PAGE分析，结果 显示该免疫抑制剂获得了表达，Mt为17000，其表达量为菌体总蛋白量的30％。Western blot结果证实，该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应。对该表达蛋白进行了阴离子交换柱纯化，获得的重组蛋白的纯度可达95％以上。对该蛋白的体外杀伤活性检测表明，该蛋白已完全丧失了TNF-α的体外杀伤活性。结论 上述实验结果证明，TNF-α免疫抑制剂的构建获得了成功，该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性，为其下一步治疗作用的研究奠定了基础。     

GM-CSF对MUC1基因疫苗抑制乳腺癌生长的增强作用

目的 :观察GM CSF有无增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用。方法 :采用股四头肌肌肉注射法 ,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,每 3wk 1次 ,共 3次。每次基因免疫后 1、3、5d ,皮下注射GM CSF 10 0 μL(1μg/ 10 0 μL)。最后 1次基因免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞。两周后观察、记录肿瘤的生长情况。于肿瘤细胞接种后第 4 3天 ,处死全部动物 ,称量肿瘤的质量。用 4h51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性。结果 :接种肿瘤细胞后 4 3d ,MUC1基因疫苗加GM CSF组、MUC1基因疫苗组、pcDNA3.1加GM CSF组及pcDNA3.1组 ,EMT6肿瘤的大小依次为 (135± 33.8)mm3 、(2 5 0± 34.3)mm3 、(5 6 8± 4 3.6 )mm3 和 (5 96± 4 8.2 )mm3 ;平均瘤质量 (g)依次为 (0 .81± 0 .4 2 )g、(1.2 3± 0 .4 1)g、(2 .30± 0 .4 8)g及 (2 .2 8± 0 .5 8)g。与对照组相比较 ,MUC1基因疫苗组EMT6肿瘤的生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;与单独MUC1基因疫苗组相比较 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组抗肿瘤生长的作用有显著差异 (P <0 .0 5 )。在效靶比为 10 0∶1、5 0∶1、2 5∶1和 12 .5∶1时 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率 ,依次为 6 8.5 %、 5 3.4 %     

随机十肽库的构建及血管形成素结合肽的筛选

将合成的含有随机序列 (NNK) 1 0 的寡核苷酸片段 ,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒 p CANTAB5 E的 Sfi ,N ot 位点 ,即 cp 蛋白信号肽与成熟肽之间 ,电转化 E.coli TG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库 ,实际库容为 3.5 3× 10 7,插入率为 6 6 .7% .经辅助噬菌体 M13KO7超感染后 ,获得滴度为 4.8× 10 1 1 pfu/ m l的噬菌体上清 .经过两轮 panning筛选和富集 ,从构建的随机十肽库中筛选到 2 6个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆 ,对其中 12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析 ,EL ISA检测结果显示 12个阳性噬菌体克隆都能够…     

胸腺素A1基因串联体的构建

0　引言　胸腺素 α1(Thymosin alpha1,Tα1)是从胸腺素组分 5 (TF5 )中分离纯化出的热稳定酸性多肽 [1 ] ,由 2 8个氨基酸组成 ,Mr为 310 8.它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂 ,已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷的研究中 .虽然胸腺素 α1有着广泛的应用前景 ,但由于其基因过短 ,很难利用基因工程方法实现直接表达 ,所以目前多是化学合成产品 [2 ] ,价格比较昂贵 ,应用的推广受到限制 .为了探索胸腺素α1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达 ,我们利用随机退火与 PCR技术相结合的方法构建了胸腺素α1的多串体基因 …     

白细胞介素4剪接变异体在哮喘患者中的表达

目的检测哮喘患者外周血中IL-4及其变异体IL-4δ2的表达,探讨其在哮喘发病机制中的作用。方法采用半定量RT-PCR技术,检测10例哮喘患者IL-4及其变异体的表达,并与正常健康人群进行比较。结果哮喘患者IL-4表达较健康人群高,而且IL-4和IL-4δ2的比值远远高于健康人。结论IL-4和IL-4δ2表达的相对性可能在哮喘发病机制中具有重要作用,其可能是Th2细胞在不同临床疾病中功能多样性的原因之一。     

噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定

目的:从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(VEGF)mAb阿瓦斯汀(Avastin)特异性结合的多肽.方法:用Avastin为靶分子,对噬菌体12肽库进行3轮生物淘洗,随机挑取80个克隆,ELISA法鉴定其亲和性,将亲和性高的阳性克隆进行DNA序列测定,推导与噬菌体外壳融合的12肽氨基酸序列.Fmoe固相法合成12肽,戊二醛交联12肽与血蓝蛋白(KLH),打点印迹(Dot blot)检测偶联物能否与Avastin结合.结果:ELISA显示,42个噬菌体克隆与Avastin有较强的亲和性,测序发现41个阳性克隆表达的融合12肽的序列一致,1个不同;化学合成的12肽能与Avastin特异性结合,12肽-KLH偶联物也能与Avastin特异性结合.结论:初步证明12肽模拟了VEGF部分表位.     

血管生长抑制因子基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的;获得具有高活性的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ表达,为进一步研究及应用奠定物质基础。方法：用ＰＣＲ法人纤维蛋白酶原ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ基因中,获得Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４）基因,测序验证后,将正确的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（Ｋ１－４）序列,插入Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞ｓｆ９,表达Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ。结果：获得了正确序列Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

人血管形成素cDNA克隆和序列分析

０　引言　人肿瘤的发生、转移和血管形成密不可分．近年来,已发现多种具有血管形成活性的因子,如纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）,转化生长因子（ＴＧＦ）,血管形成素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）等．其中血管形成素是第一个肿瘤来源的具有血管形成活性蛋白,在体外可以诱导鸡胚绒毛尿囊膜及兔角膜血管形成［１］,因此可能在肿瘤发生中有重要作用．文献［２,３］报道,从人肝ｃＤＮＡ文库中获得人血管形成素的基因全长,并推导出氨基酸．我们利用ＲＴＰＣＲ从人肺癌细胞株Ａ５４９中提取总ＲＮＡ,成功克隆了人血管形成素ｃＤＮＡ,其序列…     

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽

目的 研究ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＵＳ－ＰＡＧＥ）显示小分子多肽的方法。方法 观察不同方法处理的样品，上样量对电流晰影响及对分子量标准（Ｍ，２５１２＝１６９４９）进行直线回归分析，结果 样品和不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔５～１０μｇ较佳；分子量标准直线回归系数ｒ＝－０．９６２。结论 样品处理方便，上样量少，在１６０ｇ．Ｌ＾－１Ｔ，６０ｇ．ｋｇ＾－１Ｃ较低的丙烯酰胺     

pEGX—e23（scFv）PE40融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达抗原癌基因c-erbB-2表达产物p185的单链抗体e23(scFv)／假单孢菌属外毒素活性片段PE40免疫毒素的融合,9搂乳腺癌、胃癌等多种c-erbB-2呈过量表达的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法 去除克隆在真核表达载体pLNCX中的e23(scFv)PE40基因5′端编码信号肽的核苷酸序列，并将改建后的融合基因克隆到原核融蛤 表达载体pGEX-4T中表达。结果 序列测定表明，改建后抗p185 e23(scFv)／PE40序列正确。融合基因经IPTG诱导表达4h后，经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，在Mr90000处出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的15％。结论 成功改建并在原核中表达了抗p185 e23(scFv)PE40融合蛋白。