稳定整合靶向性Survivin基因RNA干涉载体胶质瘤细胞系的建立

目的构建针对细胞凋亡抑制蛋白survivin（SVV）基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系。方法设计合成针对SVV基因和针对荧火虫荧光素酶（FLF）基因特异性RNA干涉片断,并分别克隆入pSilencer3．1-H1neo载体中,成功构建SVV基因RNA干涉载体pSilencer3．1-SVV和无关序列载体pSilencer3．1-FLF。RNA干涉载体、无关序列载体和空白载体经脂质体法转染胶质瘤细胞系U251,经G418筛选,采用实时定量反转录聚合酶链反应（real—timeRT—PCR）、免疫蛋白印迹（Western blot）和免疫细胞化学方法分别检测SVV基因在转染细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了SVV基因RNA干涉载体pSilencer3．1-SVV。获得了稳定转染干涉载体、无关序列载体和空白载体的细胞系分别命名为U251-S、U251-F和U251-P。U251-S细胞中SVV的mRNA和蛋白表达受到明显抑制,U251-F和U251-P细胞中SVV基因表达水平无明显变化。结论SVV基因特异性RNA干涉载体能够明显抑制SVV基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究SVV在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

短发卡RNA特异性抑制Survivin基因在U251细胞中的表达

目的构建针对人Survivin基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其在人脑胶质母细胞瘤U251细胞中对Survivin基因表达的抑制作用.方法根据Survivin cDNA编码序列,设计并合成针对Survivin基因的特异性RNA干涉片断,将其克隆入pWH1质粒载体,构建Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR.通过脂质体介导将pWH1-SR载体和空载体pWH1分别转染入U251细胞,经G418筛选,建立稳定转染的细胞系U251-SR和U251-P.采用RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测Survivin mRNA和蛋白在U251、U251-P和U251-SR细胞中的表达水平.结果成功构建了Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR,经酶切鉴定证实克隆正确.获得了稳定转染pWH1-SR载体和空载体pWH1的细胞系U251-SR和U251-P.U251-SR细胞Survivin mRNA和蛋白表达均受到明显抑制,抑制率分别达87%和91%;U251-P细胞Survivin基因表达水平无明显变化.结论特异性shRNA能够明显抑制Survivin基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究Survivin在U251细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

RNA干涉脑胶质瘤MSP58基因后肿瘤转移相关基因的表达变化

目的采用基因芯片技术,观察RNA干涉法抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞MSP58基因表达后肿瘤转移相关基因的变化,从而了解MSP58在肿瘤转移相关基因通路中的可能定位。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1-MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251,同时构建相应的阴性对照载体pSilencer3．1-NC以及空载体pSilencer3．1-H1 neo。运用半定量RT-PCR及Western blot的方法检测稳定转染和未转染干涉载体的胶质瘤细胞MSP58的mRNA和蛋白的表达水平。运用基因芯片技术分析pSilencer3．1-MSP58转染后肿瘤转移相关基因表达的变化。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞、阴性对照U251-NC细胞以及含有空载体的U251-H1 neo细胞。干涉组细胞的MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平均较阴性对照组及空载体组细胞显著降低。基因芯片技术共筛选肿瘤转移相关基因128个,其中上调2倍以上的共有34个基因。结论干涉MSP58基因表达后,胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的下降与肿瘤转移相关基因表达的变化有关。     

RNA干涉MSP58基因抑制神经胶质瘤细胞U251增值和侵袭性研究

目的MSP58是一种能够通过调节基因的转录和翻译水平来改变细胞恶性表型的癌基因，其蛋白的分子量大小为58kDa。但截止目前，其在肿瘤发生及发展中所起的作用仍不是十分清楚。我们通过构建MSP58基因的干涉表达载体，下调MSP58基因在人脑胶质瘤细胞系U251中的表达以揭示其在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1-MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251，同时构建相应的阴性对照载体pSilencer3．1-NC以及空载体pSilencer3．1-H1neo。运用半定量RT-PCR及Westernblot的方法检测稳定转染和未转染干涉载体的胶质瘤细胞的MSP58的mRNA和蛋白的表达水平。运用MTT法测定胶质瘤细胞的增殖水平。流式细胞仪检测细胞周期变化以及单层细胞划痕试验和侵袭小室试验检测胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力变化。结果成功建立了三种稳定转染细胞株：分别是具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞，阴性对照U251-NC细胞以及含有空载体的u251．H1neo细胞。干涉组细胞的MSP58的表达水平无论在mRNA水平还是在蛋白水平均较阴性对照组及空载体组细胞显著降低。其表达抑制率分别为62．7％和60．3％。干涉组细胞的增殖能力明显降低。同时在细胞周期方面，干涉组细胞与阴性对照组及空载体组细胞相比，发生了显著的G1期阻滞。细胞迁移及侵袭试验结果显示，MSP58干涉组的细胞较其他对照组细胞的迁移及侵袭能力均受到明显抑制。结论通过RNA干涉的方法下调MSP58基因的mRNA和蛋白的表达，不但可以明显的抑制人脑胶质瘤细胞的增殖，并且可以显著的抑制胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力。因此，靶向性MSP58基因RNAi介导的胶质瘤基因治疗具有良好的应用前景。     

RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.     

锌指蛋白A20 RNAi载体的构建及筛选

目的我们前期的实验结果显示A20 mRNA和蛋白在人脑胶质瘤组织及细胞系（U251、U87、BT325）中高表达，本研究拟构建A20RNAi载体，并检测其对U251细胞A20表达的抑制作用。方法构建三种针对人A20基因的真核干涉表达载体，以脂质体法将其分别转染人脑胶质瘤细胞系U251，以RT-PCR、蛋白印迹法检测各干涉载体对U251细胞中A20mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果成功构建三种针对A20基因的RNAi载体，经RT-PCR、蛋白印迹检测筛选出对A20基因干涉效果最佳的载体，命名为pSilencer3．1-A20R1。结论成功构建A20基因干涉载体，为进一步探讨A20与脑胶质瘤恶性增殖、血管形成以及抗凋亡的关系奠定实验基础。     

稳定转染基因ndrg2脑胶质瘤细胞系的建立

目的建立稳定转染ndrg2基因的脑胶质瘤细胞系，以探索及研究该基因的功能。方法以低表达ndrg2基因的脑胶质瘤细胞系U251为材料，以ndrg2基因转染U251细胞系，经G418进行筛选后，挑取单克隆进行培养，用荧光显微镜观察、逆转录酶聚合酶链反应（RT—PCR）验证获得的表达细胞株。结果经转染和G418筛选后，荧光显微镜下见有明显表达ndrg2基因的细胞约占70％-80％，RT-PCR检测到转染基因ndrg2后细胞ndrg2的高表达，而转染空载体的细胞ndrg2低表达。结论成功建立了稳定转染基因ndrg2的脑胶质瘤细胞系U251，为进一步探讨该基因的功能奠定了一定基础。     

LRIG3特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建LRIG3（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3,LRIG3）基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制LRIG3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的LRIG3基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发卡RNA（shRNA）的DNA序列,命名为LRIG3-shRNA1、LRIG3-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶SalⅠ酶切电泳,DNA测序鉴定。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株。逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG3的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经SalⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG3-shRNA组细胞LRIG3 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组。结论成功构建针对LRIG3基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制LRIG3基因表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

MSP58基因RNA干涉后对人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的影响

目的观察RNA干涉法（RNA interference,RNAi）抑制人脑胶质瘤U251细胞的MSP58基因表达后,对其在裸鼠体内成瘤性及增殖、侵袭性的影响。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1．MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251（U251．S）,同时构建相应的阴性对照组U251-NC,以及空载体组U251-H1neo。运用逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）及蛋白质印迹法（Westernblot）检测各组细胞的MSP58mRNA和蛋白表达水平。用各组U251细胞建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞。U251-S细胞MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均较U251组、U251-H1neo组及U251-NC组细胞显著降低（P〈0．01）。与接种U251、U251-H1neo和U251-NC细胞的裸鼠相比,接种U251-S细胞的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小（P〈0．01）。结论MSP58基因RNAi后抑制了移植瘤细胞MSP58mRNA及蛋白的表达,进而明显抑制移植瘤的增殖和侵袭能力。     

NUMB shRNA真核表达载体构建及对人U87胶质瘤细胞NUMB、p53表达的影响研究

目的：构建NUMB shRNA（短发夹RNA）真核表达载体,体外评价其对人U87胶质瘤细胞NUMB及p53 mRNA及P53蛋白表达的影响。方法：免疫荧光细胞化学染色证实NUMB、P53蛋白在U87胶质瘤细胞的表达。构建针对NUMB mRNA表达的一对反向shRNA互补序列,克隆入psilencer 3．1／hygro真核表达载体,在测序鉴定无误后将NUMB shRNA转染至U87胶质瘤细胞,用RT—PCR和Western blot检测U87细胞转染前后NUMB及p53基因和P53蛋白的表达水平变化。结果：基因测序证实质粒构建成功,RT—PCR和Western blot结果证实U87细胞转染NUMB shRNA后48hNUMB mRNA及蛋白表达水平均下降,P53蛋白表达水平也明显下调。结论：在U87胶质瘤细胞中,NUMB参与了P53蛋白表达水平的调控,提示NUMB是一个潜在的脑胶质瘤基因及药物治疗的靶点。     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

特异性shRNA干扰人慢病毒载体抑制U251细胞株Chk1、Chk2基因的表达

目的构建针对细胞周期检测点激酶1和2(Chk1和Chk2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,包装成慢病毒,建立稳定转染的细胞株,为探讨抑制Chk1和Chk2基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的Chk1和Chk2基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,命名为Chk1-shRNA和Chk2-shRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为blank-shRNA。并与pLKO.1-TRC质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶EcoRⅠ、NcoⅠ酶切电泳,DNA测序鉴定,包装慢病毒。3组重组表达慢病毒载体转染胶质瘤细胞系U251,用嘌呤霉素筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株。逆转录酶-聚合酶连反应(RT-PCR)和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测Chk1和Chk2的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。嘌呤霉素对U251细胞的筛选浓度为4ug/ml,筛选出稳定转染三种质粒的U251细胞,Chk1-shRNA和Chk2-shRNA组细胞各自Chk1和Chk2的mRNA和蛋白表达水平明显低于blank-shRNA组。结论成功构建了针对Chk1和Chk2基因的shRNA慢病毒表达载体,转染后可抑制ChK1和Chk2基因的表达,为进一步研究Chk1和Chk2基因在脑胶质瘤细胞中的作用奠定了基础。     

RNAi对U251细胞c-Met基因表达水平的影响

目的 探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤U251细胞c-Met基因表达的影响。方法 设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,pGenesil-1质粒为载体,构建pGenesil-1/c-Met-shRNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤U251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建pGenesil-1-c-Met shRNA重组质粒,并转染至U251细胞。转染重组质粒的U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结论 RNA干扰能明显降低U251细胞c-Met基因mRNA和蛋白的表达水平。     

下调RNF138基因对胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡及细胞周期影响的研究

目的探讨RNA干扰下调胶质瘤细胞株高表达基因RNF138对胶质瘤细胞株U251体外增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法构建下调RNF138基因的siRNA,通过慢病毒转染导入胶质瘤细胞株U251,设立阴性干扰对照组及空白对照组,荧光显微镜观察转染效率;实时荧光定量PCR检测敲减效率;运用Cellomics仪器连续检测U251体外增殖情况;流式细胞仪检测U251凋亡及细胞周期变化情况。结果慢病毒载体高效、稳定转染U251细胞,靶向RNF138的siRNA有效抑制RNF138基因表达,使RNF138mRNA表达减少60%,U251体外增殖明显减缓,凋亡明显增加,细胞阻滞在G2/M期。结论 RNA干扰抑制RNF138基因表达可以明显抑制胶质瘤细胞株U251体外增殖,促进其凋亡,影响细胞周期,阻滞细胞分裂。     

线粒体加工肽酶干扰RNA真核表达载体转染PC12细胞系的构建及鉴定

目的利用干扰RNA技术构建线粒体加工肽酶(MPPs)的干扰RNA真核表达载体,稳定转染大鼠PC12细胞来抑制MPPs基因的表达,为研究MPPs蛋白的功能提供实验基础。方法脂质体转染已经构建好的4个MPPs干扰RNA真核表达载体和阴性对照干扰RNA真核表达载体到大鼠PC12细胞株,G418筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染5个MPPs干扰RNA真核表达载体的PC12细胞系。用RT-PCR检测MPPs基因表达。结果获得稳定转染5个MPPs干扰RNA真核表达载体的PC12细胞系,RT-PCR证实所有4个干扰组(siRNA1,siRNA2,siRNA3 and siRNA4)MPPs-mRNA表达均下调,分别达到28%、38%、26%、16%。结论成功建立稳定转染MPPs干扰RNA的PC12细胞系。通过RT-PCR等相关方法证实MPPs干扰RNA真核表达载体转染PC12细胞成功。     

重组型Caspase3对U251胶质瘤细胞促凋亡作用

目的探讨由野生型人Caspase3大小亚基颠倒构建的重组型Caspase3促U251胶质瘤细胞的调亡活性。方法运用分子克隆技术,使Caspase3基因大小亚基颠倒构建,并将重组基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1中,转染人U251胶质瘤细胞。利用透射电镜和流式细胞仪观察胶质瘤细胞凋亡的生物学特征。结果成功地获得了重组型反向Caspase3基因。经限制酶酶切分析鉴定释放330及550bp片段,PCR法鉴定反向重组成功;构建了重组型Caspase3基因的真核表达载体,转染U251胶质瘤细胞后,重组型Caspase3基因在细胞中表达,电镜显示细胞呈现凋亡的典型形态学特征。流式细胞仪可见细胞凋亡峰。结论重组型Caspase3可促进U251胶质瘤细胞的凋亡。     

shRNA干扰Survivin基因后胶质瘤细胞中Survinvin及mcm2的表达及意义

目的观察小发夹状RNA(shRNA)干扰生存素(Survivin)对脑胶质瘤细胞株U251中Survivin及微小染色体维持蛋白2(MCM2)表达的影响。方法通过脂质体介导对脑胶质瘤细胞株U251、转染Survivin shRNA质粒PG-sur(p Genesil-Suvrivin)及无意义shRNA质粒PG,采用RT-PCR、Western-blot分别对未转染组(U251)、转染无意义序列组(U251-PG)及转染干扰序列组(U251-sur)检测Survivin的mRNA及蛋白表达情况,流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的细胞周期和细胞凋亡,MTT检测细胞增殖能力。采用RT-PCR、Western-blot分别检测转染前后细胞MCM2的mRNA和蛋白的表达情况。结果与其他两组比较,转染干扰序列组细胞Survivin基因的mRNA及蛋白表达抑制效果显著,细胞增殖能力降低,细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(p<0.05)。MCM2的mRNA和蛋白表达显著降低。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生凋亡及细胞周期阻滞。且本试验结果表明MCM2是一可靠的细胞增殖标记物,且与Survivin之间不是各自孤的,两者间可能起协同作用共同参与胶质瘤的发生。     

靶向AKT1和COX-2的RNAi抑制U251胶质瘤细胞侵袭的体外实验

目的应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低恶性胶质瘤细胞系U251中AKT1和COX-2表达后,在体外对细胞侵袭转移的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法构建重组腺病毒载体rAd5-A-C同时搭载靶向AKT1和COX-2的shRNA干扰序列,将其转染至恶性胶质瘤细胞系U251细胞。Realtime PCR检测RNAi后目的基因mRNA的表达水平,Western Blot检测目的基因及MMP-2、MMP-9、TIMP-2的表达情况。酶联免疫吸附试验检测转染前后分泌到细胞外的MMP-2和MMP-9的浓度变化。划痕实验和Transwell实验评价肿瘤细胞转染前后的细胞侵袭能力的变化。结果rAd5-A-C转染组AKT1和COX-2的mRNA和蛋白表达均明显抑制;MMP-2、MMP-9表达下调,TIMP-2表达则上调。ELISA检测胞外MMP-2、MMP-9浓度明显减低;划痕实验显示细胞转移运动能力明显减弱,Transwell体外侵袭实验结果显示穿过细胞数明显减低(P0.001)。结论重组腺病毒介导的RNAi技术可以序列特异性地抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达,在体外对U251细胞侵袭转移产生明显抑制作用,可能成为恶性胶质瘤治疗的新策略。     

针对MAGE-1基因RNAi在恶性胶质瘤SHG-44细胞中的作用研究

目的构建抑制黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)的siRNA表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞中对MAGE-1基因表达的干涉作用。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNA干涉(RNAi)质粒载体。利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后SHG-44细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干扰效果。结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成功插入到预计位点,并且序列与预期完全一致。稳定转染后G418筛选出的SHG-44多克隆细胞MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干涉作用。结论成功构建了针对MAGE-1基因的siRNA表达载体,抑制SHG-44细胞中的MAGE-1分子的表达。