人脑垂体生长激素腺瘤PKCδ、ERK1/2、gsp癌基因的表达关联性分析

目的 研究人脑垂体生长激素腺瘤组织中蛋白激酶Cδ亚型（PKCδ）、细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、Gs蛋白2亚基因点突变（gsp癌基因）的个体表达的关联性。方法 收集54例垂体生长激素腺瘤组织,行免疫组化检测PKCδ、ERK1/2蛋白的表达差异;通过PCR法检测gsp突变情况。结果 54例标本中,gsp癌基因（+）11例,gsp癌基因（-）43例;PKCδ表达阳性率为50%,ERK1/2表达阳性率为51.9%。11例gsp癌基因（+）标本PKCδ表达阳性率（45.5%）与gsp癌基因（-）标本表达阳性率（51.2%）无统计学差异（P>0.05）;gsp癌基因（+）标本ERK1/2表达阳性率（36.4%）与gsp癌基因（-）标本表达阳性率（55.8%）无统计学差异（P>0.05）;PKCδ（+）标本ERK1/2表达阳性率（74.1%）明显高于PKCδ（-）标本表达阳性率（29.6%,P<0.05）。结论 人脑垂体生长激素腺瘤内PKCδ与ERK1/2的表达呈正相关,而PKCδ及ERK1/2的表达与gsp突变无明显相关性。     

LRIG3特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建LRIG3（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3,LRIG3）基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制LRIG3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的LRIG3基因核苷酸序列,选择设计2条能转录短发卡RNA（shRNA）的DNA序列,命名为LRIG3-shRNA1、LRIG3-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为negative-shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,使用限制性内切酶SalⅠ酶切电泳,DNA测序鉴定。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株。逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG3的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌,经SalⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG3-shRNA组细胞LRIG3 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组。结论成功构建针对LRIG3基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制LRIG3基因表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

他莫昔芬对小胶质细胞氧糖剥夺后迁移和增殖的影响

目的:观察他莫昔芬(TAM)对氧糖剥夺(OGD)模型中小胶质细胞BV-2增殖和迁移的影响。方法:将BV-2细胞分为对照组(常规正常氧浓度+高葡萄糖+无胎牛血清培养基)、OGD组(1%氧浓度+无糖+无血清培养基)、OGD+TAM组(1%氧浓度+无糖+无血清培养基+TAM),采用划痕试验,通过免疫荧光技术检测小胶质细胞BV-2在不同氧浓度下的增殖和迁移情况。同时观察TAM对小胶质细胞活化的调节作用。结果:与对照组相比,BV-2在OGD后细胞迁移加快(P<0.05);OGD+TAM组迁移较OGD组下降(P<0.05);OGD组Ki67阳性率的BV-2明显高于对照组(P<0.05);OGD+TAM组Ki67阳性率则明显低于OGD组(P<0.05)。结论:缺氧可诱导小胶质细胞活化,雌激素受体拮抗剂TAM能有效抑制这种活化。     

LRIG1基因抑制胶质瘤细胞生长的机制

目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因与表皮生长因子受体(EGFR)在人脑胶质瘤细胞中的相互作用及其对肿瘤细胞生长影响的机制.方法 用免疫共沉淀法检测人脑胶质瘤细胞系GL15中LRIG1与EGFR的相瓦作用.构建针对LRIG1基因的干扰片段及非特异性的对照片段分别转染GL15细胞系,G418(600 mg/L)筛选出稳定株,Western blot法检测LRIG1表达的改变及其对EGFR表达的影响;嚷唑蓝(MTT)比色法检测LRIG1表达下调对胶质瘤细胞增殖的影响.结果 免疫共沉淀法表明胶质瘤细胞系GL15中LRlG1与EGFR存在相互作用.成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体,转染细胞后LRIG1基因表达下降54.7%;同时干扰组细胞EGFR蛋白水平与阴性对照组比较上升了57.1%.MTT结果显示干扰组细胞增殖率高于对照组.结论 LRIG1通过与EGFR结合发挥抑癌作用,干扰LRIG1表达可削弱这种作用.导致肿瘤细胞增殖加速.     

重型颅脑损伤患者血清S-100β及CRP的检测及其临床意义

目的探讨重型颅脑损伤患者血清S-100β及C-反应蛋白(CRP)动态水平变化及其临床意义。方法选取105例重型颅脑损伤患者和25例健康体检者作为研究对象。入院时,按格拉斯哥昏迷评分(GCS)将患者分为特重型组(GCS 3～5分)和重型组(GCS 6～8分);按CT检查结果将患者依损伤类型分为3组:脑挫裂伤和(或)脑内、硬膜下血肿组,弥漫性轴索损伤和脑干损伤组,硬膜外血肿组等3组。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清S-100β的浓度。用特殊蛋白分析仪检测CRP的浓度。结果重型、特重型颅脑损伤患者入院初血清S-100β和CRP含量较正常对照组升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);特重型组患者入院初血清S-100β含量高于重型组,差异有统计学意义(P<0.01);3种不同类型的颅脑损伤患者之间血清S-100β含量差异有统计学意义(P<0.05);而血清CRP含量在特重型组和重型组之间以及3种不同类型的颅脑损伤之间差异均无统计学意义(均P>0.05);动态检测结果显示,血清S-100β和CRP含量在伤后第2天达到峰值,然后血清S-100β含量迅速下降,而血清CRP含量则缓慢下降。结论重型颅脑损伤患者入院初血清S-100β及CRP水平增高与疾病的发生相关。S-100β是判断脑损伤程度比较客观的指标,其含量愈高,表示脑损伤程度愈重,且可区分不同类型的脑损伤,可作为早期监测重型颅脑损伤的特异性指标。CRP检测值不能完全区分脑损伤程度及类型。     

LRIG1过表达对顺铂诱导的胶质瘤细胞凋亡的影响及其机制

目的 研究过表达富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains-1,LRIG1)对顺铂(cisplatin,CDDP)诱导的胶质瘤细胞U251凋亡的影响及其机制.方法 应用脂质体介导的基因转染技术将对照质粒(EGFP-N1)及LRIG1质粒(EGFP-N1-LRIG1)分别转染胶质瘤细胞系U251,设为对照组和LRIG1过表达组,用Real-time PCR检测转染后LRIG1表达水平;用Annexin Ⅴ/7AAD双标流式细胞术检测细胞凋亡;用Western blot检测各目的 蛋白表达水平.结果 LRIG1过表达组LRIG1 mRNA及蛋白均较对照组明显增高;0、10、20 μg/mL CDDP作用下,LRIG1过表达组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01);随着CDDP浓度增加,胶质瘤细胞U251磷酸化表皮生长因子受体(P-EGFR)表达增加;不同浓度CDDP作用下,LRIG1过表达组P-EGFR水平均较对照组明显降低,促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低.结论 LRIG1通过下调P-EGFR水平而促进顺铂诱导的胶质瘤细胞凋亡,增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性.     

凝胶侵袭模型对胶质瘤细胞体外侵袭力研究的应用初探

目的 初步探讨凝胶侵袭模型用于人胶质瘤细胞体外侵袭力研究的可行性,观察普通培养的胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞在凝胶侵袭模型中侵袭力的差异,为胶质瘤的体外研究寻求新的实验手段.方法 经纯化的Ⅰ型和Ⅲ型胶原与MEM培养基混合制备凝胶液,将原代培养的胶质瘤细胞经悬滴法制成的细胞球和胶质瘤干细胞所形成的细胞球种植于其中,每个细胞球含(10-15)×103个细胞,在添加含有不同药物浓度基质金属蛋白酶抑制剂GM6001(0、25、50、75、100μmol/L)的相应培养基中培养4 d,测量不同药物浓度组肿瘤细胞侵袭距离及其差异.结果 不同处理组胶质瘤细胞在凝胶侵袭模型中生长良好,最初的细胞球形态呈规则圆形,随着时间的推移肿瘤细胞侵袭距离逐渐增加;且对GM6001的抑制作用表现出不同程度的剂量依赖性,以75 μmol/L GM6001对普通培养的胶质瘤贴壁细胞的侵袭抑制作用最为明显(均P=0.000);而25μmol/L GM6001对胶质瘤干细胞球的侵袭抑制作用最显著(P=0.002,0.012,0.000).结论 凝胶侵袭模型适用于普通贴壁培养的胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞球.     

白花蛇舌草对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响及其机制

目的 观察白花蛇舌草在体外对胶质瘤U87细胞株增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法 用不同浓度的白花蛇舌草含药培养基(0、5、10、15、20ml/L)处理U87细胞不同时间(24、72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测其对U87细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测对照组与实验组细胞的凋亡差异,免疫印迹法检测U87细胞中半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)表达水平的改变.结果 经白花蛇舌草5、10、15、20ml/L处理后,U87细胞增殖受到明显抑制,呈显著的剂量依赖性;经白花蛇舌草(5、10 ml/L)处理后U87细胞的凋亡率分别增加到(5.22±0.29)%、(8.38±0.65)%,明显高于对照组的(3.09±0.05)%(P＜0.01);白花蛇舌草可明显上调U87细胞中Caspase-3的蛋白表达,且呈浓度依赖性.讨论白花蛇舌草对胶质瘤U87细胞生长的抑制作用可能通过上调Caspase-3基因的表达从而诱导细胞凋亡实现.     

胶质瘤干细胞趋化神经干细胞迁移及其机制研究

目的 观察神经干细胞( NSC)向胶质瘤干细胞(GSC)及其分化细胞的迁移能力,探讨其趋化机制。方法 干细胞条件培养U251和3例原代胶质瘤干细胞,以流式细胞术和Western blot对其鉴定;Transwell小室法检测GSC和其分化细胞条件培养液(CM)对NSC迁移的趋化能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测CM中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌水平,并以表皮生长因子(EGF)、bFGF为对照分析CM对NSC的化学趋化作用;进一步以Dio和Dil分别标记NSC和GSC,体外混合培养观察NSC向GSC的迁移、以及对肿瘤干细胞球生长的影响。结果 干细胞培养条件下的胶质瘤干细胞球,高表达干细胞标志物Nestin和/或CD133( 11.02％～ 33.55％);分化后干细胞标志物表达下降,分化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加(P＜0.05);GSC与其分化细胞比较,分泌高水平的趋化因子VEGF和bFGF(P ＜0.05),并对NSC有高度趋化能力;体外混合接触培养也显示NSC向肿瘤干细胞球的迁移和包绕,并且能够显著抑制肿瘤干细胞球的生长(P＜0.05)。结论 GSC体外可趋化NSC向其迁移,其趋化作用较分化的肿瘤细胞更为显著,并且与其分泌高水平的生长因子有关;向肿瘤干细胞球迁移的NSC可抑制其体外生长。