新A超家族芋螺毒素Bt14.10的克隆及合成研究

目的从我国南海西沙附近海域的桶形芋螺（Conus betulinus）中克隆出新型A-超家族芋螺毒素Bt14.10,并利用化学方法合成该毒素,鉴定其二硫键连接方式。方法提取桶形芋螺毒腺管基因组DNA,基于非翻译区及内含子序列设计合成引物进行PCR,获得Bt14.10的序列。采用Fmoc-固相法合成线性肽Bt14.10,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式。结果发现一种新的A超家族芋螺毒素DNA序列Bt14.10,其编码的成熟肽序列为CAHSVPGMHPCKCNNTC-NH2,二硫键连接方式为＂C1-C3,C2-C4＂。结论BT14.10是一种新型A超家族芋螺毒素,具有A超家族芋螺毒素较为少见的ⅪⅤ型半胱氨酸骨架结构。     

中国南海新型α-芋螺毒素Im1.6的克隆及合成

目的从中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3'端快速扩增方法(3'RACE),从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Im1.6,其编码的成熟肽序列为GCCDIPDCYNKNREQC-NH2,二硫键连接方式为C1-C3,C2-C4。结论 Im1.6是一种新的α4/7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-芋螺毒素显著不同。     

中国南海新型甜芋α-螺毒素Iml．6的克隆及合成、

目的从中国南海堂皇芋螺（Conusimperialis）中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3’端快速扩增方法（3’RACE）,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Iml．6,其编码的成熟肽序列为GccDIPDCYNKNREQc—NH：,二硫键连接方式为“c1．c3,c2．C4”。结论Iml．6是一种新的α4／7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-一芋螺毒素显著不同。     

α-芋螺毒素构效关系的研究进展

α-芋螺毒素（α—CTX）是芋螺毒素的重要家族，由12～19个氨基酸、2～3对二硫键组成，是迄今发现的最小的神经肽类毒素。α-芋螺毒素能特异性地抑制肌肉型或神经元型的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），并能进一步区分不同的神经元型nAChR亚型。由于其相对分子质量小、活性高，不仅可直接开发为疗效特异的镇痛及抗癫痫等药物，还可作为研究神经生物学工具，鉴定nAChR亚型功能。本文对α—CTX研究的最新进展予以评述，着重介绍了α—CTX的作用靶位特性、构效关系及其应用进展。     

新的M家族芋螺毒素的克隆及进化分析

目的从中国南海芋螺中寻找新的M家族芋螺毒素。方法应用3′RACE及巢式PCR进行基因克隆,将得到的目的基因连接入pGM-T载体、转化并测序,用进化分析软件对得到的新序列进行进化分析。结果从6种芋螺毒腺管中获得8个新的M家族芋螺毒素前体肽序列,其成熟肽含有15~21个氨基酸残基。结论这些新的M族毒素与已报道的M家族毒素序列同源性较低,是Mini-M家族的新成员。     

α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C融合蛋白的制备及其抗血清活性研究

目的 制备α-芋螺毒素GI抗血清,为其中毒救治提供有效手段.方法 构建包含α-芋螺毒素GI、PADRE和破伤风毒素C片段(TTC)融合蛋白的原核表达载体,原核表达GI-PADRE-TFC融合蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体滴度,并测定其对小鼠的抗毒活性.结果 获得GI-TTC融合蛋白69.5 mg.GI-TTC融合蛋白免疫小鼠第5次免疫后血清对GI、GI-BSA的抗体滴度分别达到1∶102400及1∶204800.100、200 μl融合蛋白抗血清对2.0×LD50的α-芋螺毒素GI中毒小鼠存活率分别为14.3％、25.0％,且小鼠死亡时间显著延长.结论 α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C片段的融合蛋白具有较好的免疫原性,其产生的抗血清对α-芋螺毒素GI具有一定中和活性.     

基于无细胞蛋白合成系统体外合成芋螺毒素µ-PⅢA

目的 利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统(CFPS)体外合成芋螺毒素Mu-conotoxin PⅢA(μ-PⅢA).方法 通过PCR扩增芋螺毒素μ-PⅢA肽前体3种肽段(信号肽、前体肽与成熟肽)不同组合的DNA片段,将其分别克隆到pIVEX-2.4d载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定后得到阳性克隆.在大肠杆菌CFPS体系中加入芋螺毒素μ-PⅢA体外合成所需反应液以及重组表达质粒并开始反应.最后用Western印迹对合成的芋螺毒素μ-PⅢA进行鉴定.结果 双酶切和基因测序表明,pI-p3a1、pI-p3a2和pI-p3a3原核表达质粒均构建成功,Western印迹结果表明,通过CFPS体外合成出芋螺毒素μ-PⅢA.结论 应用CFPS实现了芋螺毒素μ-PⅢA的可溶性表达,为芋螺毒素翻译后修饰机制研究奠定了实验基础.     

钠通道芋螺毒素研究进展

钠通道芋螺毒素是芋螺毒素的重要家族,由17～33个氨基酸、3对二硫键组成.它们能特异作用于神经型或肌肉型钠通道及其亚型,分属δ-、μ-、μO等类型.由于其分子量小、特异性高,是钠通道及其亚型生理、药理功能的优良探针,本身也有潜力发展成为无致瘾镇痛药.本文简要综述δ-、μ-钠通道芋螺毒素的作用机制以及结构与活性关系的最新进展.     

小肽促进α-突触核蛋白正常折叠的研究

目的:在大肠杆菌中研究小肽促进α-突触核蛋白(α-synuclein, α-Syn)(Α53T, S129Α)的正常折叠.方法:利用分子生物学和生物信息学技术,以α-Syn的疏水区域为基础,设计了4种小肽(Pn:P1～P4);构建融合蛋白α-Syn-GFP,使α-Syn基因位于GFP上游,各种小肽以双顺反子方式与α-Syn-GFP共同表达;以文献报道的有效促进α-Syn正常折叠的小肽Pc(MGGΑVVTGR)为对照,利用融合蛋白折叠在细菌中可视化技术研究小肽Pn影响α-Syn(Α53T, S129Α)的正常折叠的效果.结果:4种小肽均能更好地促进α-Syn(S129A)的正常折叠;和对照Pc相比,小肽P2(MRGGΑVVTGR)使α-Syn(A53T)正常折叠提高了10%,小肽P4(MRVGGΑVVR)使α-Syn(S129A)正常折叠提高了83%.结论:在大肠杆菌中,小肽可以不同程度的促进α-Syn(Α53T, S129Α)的正常折叠.     

鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对CCI大鼠脊髓及坐骨神经iNOS蛋白表达的影响

目的 通过检测鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)模型大鼠脊髓及坐骨神经诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响,探讨慢性神经痛发展过程中Ca2 对iNOS的作用.方法 雄性SD大鼠40只,随机分为4组(n=10):N组为正常对照组,C组为CCI后14天组,CN组为CCI 7天后连续鞘内注射生理盐水7天组,CS组为CCI 7天后连续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3(30ng/h)7天组.用Western blot方法检验各组动物脊髓及坐骨神经结扎部位中段和远端iNOS蛋白表达量的变化.以GAPDH表达量作为内参照.结果 正常大鼠脊髓及坐骨神经标本未见iNOS表达,CCI大鼠结扎侧坐骨神经及同侧脊髓均有较强的iNOS表达,持续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3后此种表达减弱.结论 CCI大鼠脊髓和受损坐骨神经iNOS表达增加,鞘内注射ω-芋螺毒素SO3可降低CCI大鼠上述部位iNOS表达.在慢性神经痛的发展过程中,Ca2 通道阻滞剂对iNOS的表达有一定作用.     

烟碱型乙酰胆碱受体的激动与阿尔茨海默病的治疗

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)广泛存在于神经系统中,与大脑的认知功能密切相关。近年研究发现,nAChR特别是其中的α7和α4β2两种亚型的激动可以通过多种机制对阿尔茨海默病(AD)的认知记忆损伤起改善作用。激动烟碱型乙酰胆碱受体可以诱导其功能上调使胆碱能功能维持在正常水平,可以拮抗Aβ的毒性,还可以通过调节下游信号转导从而起到改善认知记忆的作用。目前人们已经研究开发了多种选择性的nAChR激动剂,其中一些已经进入了临床试验阶段,包括GTS-21、ABT-418、奈非西坦等,希望从中可以找到有效的AD治疗药物。本文将就激动nAChR改善认知记忆的机制和已有的选择性nAChR激动剂作一综述。     

神经型烟碱乙酰胆碱受体PET显像放射性配体研究进展

基于人类脑神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs) PET显像的研究已取得显著进展,尤以脑内最主要的nAChRs亚型,即α4β2亚型nAChRs(α4β2-nAChRs)显像为著.对于脑内另一种主要的nAChRs亚型,即α7亚型nAChRs(α7-nAChRs)的PET显像研究亦有报道.笔者就近年来神经型nAChRs PET显像放射性配体的研究进展予以综述.     

SO3—一种新型具镇痛活性的芋螺多肽

目的：通过对中国南海线纹芋螺毒素的基因克隆、多肽的化学合成 量筛选,获得一种具有镇痛作用的芋螺多肽SO3。该太含有25个氨基酸残基CKAAGKPCSRIATNCCTGSCRSGKC－NH2,三对二硫键,其作用靶位为N型钙通道。方法：小鼠采用侧脑室给药,每只20μl。小鼠镇痛活性采用热板法、光热辐法及扭体法测定,大鼠采用脊髓鞘内套管给药,每只10μl,大鼠镇痛活性采用烫尾法及尾部压痛法。结果：生物活性测这表明该肽对小鼠的镇痛活性ED50为0．75μg/kg,对小鼠的急性毒性试验LD50为13．5mg/kg.LD50比ED50大18000倍,具有很高的用药安全性。论：国外已进入Ⅱ-Ⅲ期临床实验的ω－芋螺毒素MVIIA进行对照实验的结果表明两者活性相当,SO3毒副作用更低,而且作用靶位与MVIIA类似,无成瘾性。SO3具有诱人的药物发展前景。     

放射性核素标记RGD序列多肽与整合素αvβ3受体显像的研究进展

整合素主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互黏附,对细胞的黏附、增殖、分化、转移、凋亡起到重要的调控作用,在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用.成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统中,整合素αvβ3受体表达缺乏或几乎不能被探及,但其在新生血管内皮细胞中有强烈表达,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽是整合素αvβ3受体的特异性识别位点,因此,将放射性核素标记到含有RGD序列的肽类化合物上,用于整合素αvβ3受体显像,对于肿瘤早期和高特异性定位、定量诊断及治疗都具有重要意义.近年来国内外对RGD肽的标记方法和αvβ3受体显像进行了研究.     

尼古丁作用下牙周膜细胞c-Fos通路表达变化的相关研究

目的 探索尼古丁作用于人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligam ent fibroblasts,hPDLF)后c-Fos通路相关因子的表达变化,为揭示其参与吸烟相关性牙周炎的可能功能作用提供理论依据.方法 改良组织块法培养hPDLF,时间和浓度梯度实验选择理想尼古丁作用时间及浓度,qPCR及蛋白印迹实验分别观察尼古丁和/或α-银环蛇毒素(α-Bungatoxin,α-BTX)作用于牙周膜细胞后c-Fos mRNA及蛋白表达.结果 尼古丁作用于hPDLF后,c-FosmRNA和蛋白表达上调,变化具有浓度和时间依赖性.10-5 M尼古丁作用于牙周膜细胞1 h后,c-Fos mRNA及蛋白的表达上调最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05).尼古丁特异型受体烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(α7 acetylcholine receptor,α7 nAChR)特异性拮抗剂α-BTX可显著逆转这一作用,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 尼古丁可能通过α7 nAChR调节c-Fos表达及活性从而在吸烟相关性牙周炎中发挥破坏作用.     

急性乙肝患者HBV特异性CD8T细胞受体基因的克隆分析

目的探讨急性乙肝患者HBV特异性CD8 T细胞受体(TCR)参与免疫应答的分子机制。方法分离HLA-A2阳性急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs),用荧光标记的CD3、CD8抗体和五聚体染色,流式细胞仪检测HBsAg183-191和HB-sAg335-343特异性CD8 T细胞频率。取6例患者PBMCs,用HBsAg335-343表位多肽诱导培养3~4周,用磁珠分选出CD8 T细胞后再用流式细胞术分选HBV特异性CD8 T细胞,经IL-2/CD3抗体/CD28抗体扩增后提取细胞mRNA,用cDNA5′末端快速扩增技术获取TCR分子α链和β链全长可变区基因片段并进行克隆和测序,每个样本的克隆测序数≥50个。确定TCRα、β链基因家族并比较CDR3区序列特点。结果 6例患者样本600多个TCRα、β链克隆基因序列分析结果表明,HBV特异性CD8 T细胞均呈现TCR分子α、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以2~4种α链和1~4种β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和23链家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β链基因均为β13家族。同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、β链CDR3区序列相差较大。结论经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CD8 T细胞具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。     

82~C标记派唑嗪-α_1肾上腺素受体拮抗剂的合

神经递质去甲肾上腺素与人类大脑皮层抑制活动有关.基于特殊药物的亲合力,与去甲肾上腺素结合的受体分为α_1、α_2和β亚型.α_1肾上腺素受体能被抗体高血压药哌唑嗪(pragosin,2-〔4-(2-呋喃甲酰)哌嗪-1〕-4氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉)阻断.本文报道在哌嗪7位甲氧基上~(11)C标记合成.首先制备〔(11)C〕CH_3I,然后和哌嗪的脱甲氧基化合     

99Tcm标记新型RGD环肽在神经胶质瘤动物模型的实验研究

Objective (1) To evaluate the effect of insertion of two 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic (2 PEG4 ) linkers into cyclic Arg-Gly-Asp (RGD) Dimer E [c(RGDfK)]2 on receptor binding in vitro, (2) to assess its biodistribution in vivo and (3) to investigate the value of 99Tcm labeled 2PEG4-Dimer for integrin αvβ3-positive tumors imaging.Methods The expression of U87 human glioma cells and integrin αv β3 was determined by immunofluorescence staining.The half-inhibition concentrations (IC50) for 125 I-cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (c(RGDyK) ) of c ( RGDyK ), hydrazinonictinamide ( HYNIC )-Dimer and HYNIC-2PEG4-Dimer binding to integrin αvβ3 were measured.99Tcm-HYNIC-Dimer and 99Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer were synthesized using non-SnCl2 formulation.Biodistribution and imaging studies were performed in nude mice bearing human glioma xenografts.The unpaired t test was used for statistical analysis.Results The labeling yield of the two radiotracers was more than 95%, and the radiochemical purity was more than 99% through Sep-Pek C18 cartridge.HYNIC-2PEG4-Dimer had significantly higher binding affinity of integrin αvβ3 than c(RGDyK) and HYNIC-Dimer (IC50 = 0.8 nmol/L, 27 nmol/L and 2.4 nmol/L, respectively).Biodistribution study showed that 99Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer was mainly excreted via the kidney.The tumor uptake of 99Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer was higher than that of 99Tcm-HYNIC-Dimer at 2h post injection ((5.71 ±0.96) and (2.10 ±0.50) % ID/g, t =4.80, P＜0.05).The xenografted tumors were visible at 0.5 h post injection and the image contrast increased with time due to the tracer clearance of the background tissue.Conclusion 99 Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer is a promising radiotracer for integrin αvβ3-positive tumor imaging.     

99Tcm标记新型RGD环肽在神经胶质瘤动物模型的实验研究

Objective (1) To evaluate the effect of insertion of two 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic (2 PEG4 ) linkers into cyclic Arg-Gly-Asp (RGD) Dimer E [c(RGDfK)]2 on receptor binding in vitro, (2) to assess its biodistribution in vivo and (3) to investigate the value of 99Tcm labeled 2PEG4-Dimer for integrin αvβ3-positive tumors imaging.Methods The expression of U87 human glioma cells and integrin αv β3 was determined by immunofluorescence staining.The half-inhibition concentrations (IC50) for 125 I-cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (c(RGDyK) ) of c ( RGDyK ), hydrazinonictinamide ( HYNIC )-Dimer and HYNIC-2PEG4-Dimer binding to integrin αvβ3 were measured.99Tcm-HYNIC-Dimer and 99Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer were synthesized using non-SnCl2 formulation.Biodistribution and imaging studies were performed in nude mice bearing human glioma xenografts.The unpaired t test was used for statistical analysis.Results The labeling yield of the two radiotracers was more than 95%, and the radiochemical purity was more than 99% through Sep-Pek C18 cartridge.HYNIC-2PEG4-Dimer had significantly higher binding affinity of integrin αvβ3 than c(RGDyK) and HYNIC-Dimer (IC50 = 0.8 nmol/L, 27 nmol/L and 2.4 nmol/L, respectively).Biodistribution study showed that 99Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer was mainly excreted via the kidney.The tumor uptake of 99Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer was higher than that of 99Tcm-HYNIC-Dimer at 2h post injection ((5.71 ±0.96) and (2.10 ±0.50) % ID/g, t =4.80, P＜0.05).The xenografted tumors were visible at 0.5 h post injection and the image contrast increased with time due to the tracer clearance of the background tissue.Conclusion 99 Tcm-HYNIC-2PEG4-Dimer is a promising radiotracer for integrin αvβ3-positive tumor imaging.     

HLA-B*2705-β2 m-多肽复合物的制备及纯化

目的:制备并纯化HLA-B*2705-β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)-多肽复合物.方法:将pET21a-HLA-B*2705和pET21a-β2m质粒在宿主菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达,高效表达的HLA-B*2705蛋白与β2m,在HLA-B*2705限制性抗原肽[来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)gp120蛋白的九肽NH2-GRAFVTIGK-COOH]存在的情况下,通过稀释复性折叠成HLA-B*2705-β2m-多肽复合物单体,经Western印迹鉴定,分子筛纯化.结果:成功地制备出HLA-B*2705-β2m-多肽复合物.结论:HLA-B*2705-β2m-多肽复合物的成功制备及纯化,为进一步研究HLA-B*2705与NK细胞Ig样受体(killer Ig-like receptor,KIR)之间的相互作用奠定了基础.